基于2型糖尿病肥胖小鼠模型探究维生素D对脂肪组织铁死亡的影响

Investigating vitamin D's effect on adipose tissue ferroptosis in type 2 diabetic obese mouse models

摘要

目的 探讨维生素D对2型糖尿病肥胖小鼠脂肪组织铁死亡的影响作用。方法 选择6周龄db/db小鼠，分为维生素D缺乏组（LVD）、维生素D正常组（NVD）、维生素D补充组（HVD），另选择非糖尿病同窝db/m小鼠作为对照组。采用苏木精-伊红染色各组小鼠脂肪组织，生化法检测脂肪组织中铁、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，Western blotting检测转铁蛋白受体1(TFR1)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白相对表达量。结果 与对照组相比，LVD组小鼠脂肪细胞体积变大（P <0.05）；与LVD组相比，NVD组和HVD组小鼠脂肪细胞体积均变小（P <0.05）;HVD组细胞排列较整齐，大小较均一。与对照组相比，LVD组小鼠脂肪组织内铁含量、MDA水平均升高（P <0.05）,SOD、GSH水平均降低（P <0.05）；与LVD组相比，NVD组和HVD组脂肪组织内铁含量、MDA水平均降低（P <0.05）,SOD、GSH水平均升高（P <0.05）。与对照组相比，LVD组脂肪组织GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量均降低（P <0.05）,TFR1蛋白相对表达量升高（P <0.05）；与LVD组相比，NVD组和HVD组GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量均升高（P <0.05）,HVD组TFR1蛋白相对表达量降低（P <0.05）。结论 维生素D可能通过SLC7A11/GPX4信号通路改善2型糖尿病肥胖小鼠脂肪组织铁死亡。

Abstract

Objective To investigate vitamin D's effect on ferroptosis in adipose tissue of type 2 diabetic obese mice. Methods Six-week-old db/db mice were divided into vitamin D-deficient (LVD), normal vitamin D (NVD), and vitamin D-supplemented (HVD) groups. Non-diabetic db/m mice served as controls (NC). Adipose tissues underwent hematoxylin-eosin staining. Iron, glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD), and malondialdehyde (MDA) levels were measured biochemically. Western blotting detected transferrin receptor 1 (TFR1), solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11), and glutathione peroxidase 4 (GPX4) protein expression. Results Versus NC group, LVD group showed larger adipocytes (P < 0.05). Versus LVD group, NVD and HVD groups exhibited smaller adipocytes (P < 0.05), with HVD displaying more orderly, uniform cell arrangement. Compared to NC, LVD had higher adipose tissue iron and MDA levels (P < 0.05) but lower SOD and GSH levels (P < 0.05). Versus LVD, NVD and HVD showed reduced iron and MDA (P < 0.05) but elevated SOD and GSH (P < 0.05). LVD had lower GPX4 and SLC7A11 protein expression than NC (P < 0.05), but higher TFR1 expression (P < 0.05). Versus LVD, NVD and HVD showed increased GPX4 and SLC7A11 expression (P < 0.05), while HVD had decreased TFR1 expression (P < 0.05). Conclusion Vitamin D may alleviate adipose tissue ferroptosis in type 2 diabetic obese mice through the SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

2型糖尿病 / 肥胖 / 维生素D / 铁死亡 / 氧化应激

Key words

type 2 diabetes mellitus / obesity / vitamin D / ferroptosis / oxidative stress

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）是最常见的代谢性疾病，我国超过60%的成人糖尿病患者合并超重或肥胖^[1]。脂肪组织不仅是机体的主要能量储存体，而且其通过调节营养物质的摄取和加工，在控制能量代谢方面起着至关重要的作用^[2]。肥胖会引起脂肪组织的代谢紊乱，从而导致肥胖相关并发症^[3]。铁死亡是一种依赖于铁的细胞死亡方式。研究证实，铁死亡在2型糖尿病及其并发症中发挥重要作用，而肥胖条件下的脂肪组织也伴随着铁的积累^[4]。维生素D在炎症反应等方面发挥作用，可以降低代谢性疾病和心血管疾病的风险^[5]。同时，越来越多的证据表明维生素D参与铁死亡过程^[6]。基于此，本研究旨在探讨维生素D对2型糖尿病肥胖小鼠脂肪组织铁死亡的影响。

1 材料与方法

1.1　实验动物

SPF级雄性BKS-db小鼠，6周龄，体重25～35 g，购自成都药康生物科技有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-034，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2020-230。本实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：SY2023-970）。

1.2　试剂及仪器

组织铁测定试剂盒（货号：A039-2-1）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）测定试剂盒（货号：A003-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）测定试剂盒（货号：A001-3）、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）测定试剂盒（货号：A006-2）均购自南京建成科技有限公司。冷冻离心机（型号：CF1524R）、涡旋混合器（型号：SCI-VS）均购自美国SCILOGEX公司，掌上离心机（型号：81010E）购自上海狄昊实业发展有限公司，电热恒温干燥箱（型号：101-0）购自绍兴市苏珀仪器有限公司，酶标仪（型号：SPECTRA MAX 190）购自美国Molecular Devices公司。

1.3　动物分组及给药

将24只db/db小鼠适应性喂养1周后随机分为3组，每组8只，分别为维生素D缺乏组（LVD）、维生素D正常组（NVD）、维生素D补充组（HVD）。LVD组小鼠每日通过饮食补充25 IU的维生素D₃；NVD组小鼠每日通过饮食补充1 000 IU的维生素D₃；HVD组小鼠每日通过饮食补充5 000 IU的维生素D₃^[7-8]。各组饮食对应的能量摄入均为3 600 kcal。另选择非糖尿病同窝db/m小鼠作为对照组（8只），采用AIN93标准饲料（代码LAD3001M）喂养，连续喂养12周后，处死动物并采集内脏脂肪组织进一步分析。

1.4　实验方法

1.4.1　苏木精-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色脂肪组织^[9]

固定与脱水：取新鲜脂肪组织，4%甲醛固定24～48 h，梯度乙醇（70%→100%）脱水，二甲苯透明，石蜡浸透包埋。切片：4～5 μm薄片，贴附于防脱载玻片，60 ℃烘片30 min。染色：脱蜡复水，二甲苯→梯度乙醇→水，苏木精染色5～8 min，盐酸乙醇分化，流水返蓝，伊红染色1～2 min，梯度乙醇快速脱水（95%乙醇分化脂肪空泡）。透明封片：二甲苯透明，中性树胶封固。使用普通光学显微镜在100倍视野下观察脂肪组织切片，并观察各组小鼠脂肪细胞体积与结构，采用ImageJ进行定量分析。

1.4.2　检测脂肪组织总铁水平^[10]

将小鼠脂肪组织（0.1 g）加入1 mL铁测定缓冲液充分匀浆后离心，在上清液中分别加入铁显色剂（1.5 mL）和待测样本（0.5 mL），过沸水浴（95 ℃）5 min后冷却，3 500 r/min离心10 min，再将各管上清液（1.0 mL）在光径0.5或1.0 cm、波长520 nm处测吸光度，计算样品浓度。铁含量=（测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×35.81/待测样本蛋白浓度。

1.4.3　检测脂肪组织GSH、SOD、MDA水平^[10]

脂肪组织匀浆后2 500 r/min离心10 min，取上清液待测。分别按照试剂盒说明书步骤加入待测样品及各试剂，测各管吸光度。以标准曲线样品浓度与吸光值绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.4.4　Western blotting检测转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TFR1）、溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）蛋白表达^[10]

脂肪组织样品裂解后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，将总蛋白溶液变性后冷却至室温，-80 ℃保存备用。根据制胶数量分别配置下层胶及上层胶，加足够的电泳液后上样电泳（浓缩胶电压75 V，分离胶电压100 V）。在转膜用的夹子中放入海绵垫、滤纸和经过活化的PVDF膜（甲醇活化5 s），将分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，去除气泡，300 mA恒流转膜1.5 h。将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶（TBST配）封闭30 min。用抗体稀释液将一抗稀释2 000倍，4 ℃孵育过夜，用TBST于室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min。用抗体稀释液将二抗稀释5 000倍，室温下孵育30 min后，用TBST于室温下脱色摇床上洗3次，每次5 min。放入曝光仪，先预览曝光30 s，根据预览图像来调整曝光时长得出曝光结果。采用Alpha软件分析目标条带的光密度。

1.5　统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 10统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P <0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　各组db/db小鼠脂肪组织的改变

对照组、LVD组、NVD组和HVD组小鼠脂肪体积大小分别为（6 863.64±1 417.91）、（32 298.55±12 342.48）、（17 879.32±7 071.47）、（13 283.80±3 487.55）μm³，经方差分析，差异均有统计学意义（F = 86.516，P = 0.000）。对照组小鼠脂肪细胞体积较小，大小均一且排列规则，细胞间界限清晰；与对照组相比，LVD组细胞体积变大（P < 0.05），为不规则形，大小不一，部分细胞界限不清；与LVD组相比，NVD组和HVD组脂肪细胞体积变小（P < 0.05），其中HVD组细胞排列较整齐，大小较均一（见图1）。

2.2　25-羟基维生素D₃对db/db小鼠脂肪组织铁含量、氧化应激的影响

对照组、LVD组、NVD组和HVD组铁含量、GSH、MDA及SOD水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P <0.05）。与对照组相比，LVD组脂肪组织内铁含量、MDA水平均升高（P <0.05）；SOD和GSH水平均降低（P <0.05）；与LVD组相比，NVD组和HVD组脂肪组织内铁含量、MDA水平均降低（P <0.05），SOD和GSH水平均升高P <0.05）。见表1。

2.3　25-羟基维生素D₃对db/db小鼠脂肪组织GPX4、SLC7A11和TFR1蛋白表达的影响

对照组、LVD组、NVD组和HVD组GPX4、SLC7A11、TFR1蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比，LVD组脂肪组织GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量均降低（P < 0.05），TFR1蛋白相对表达量升高（P < 0.05）；与LVD组相比，NVD组和HVD组GPX4和SLC7A11蛋白相对表达量均升高（P < 0.05），HVD组TFR1蛋白相对表达量降低（P < 0.05）；LVD组与NVD组TFR1蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2和图2。

3 讨论

2型糖尿病是由遗传和环境因素共同作用，降低了胰岛素靶组织的敏感性和胰腺β细胞的胰岛素分泌。脂肪组织不仅起到能量储存的作用，还控制着新陈代谢，由长链脂肪酸引起的代谢紊乱导致脂肪细胞的氧化应激和炎症细胞因子的产生，促进巨噬细胞浸润和全身低度炎症，进而影响能量代谢^[2]。

在多基因肥胖小鼠中，铁螯合剂可以抑制炎症因子和氧化应激的产生，以及脂肪组织巨噬细胞的浸润以改善脂肪细胞的肥大^[11]。GPX4是脂肪细胞分化和抑制脂质过氧化所必需的，而肥胖患者脂肪细胞GPX4的活性降低，同时伴随着铁蓄积^[12-13]。ZHAO等^[14]发现，高脂饮食诱导的肥胖导致特定标志物的基因相对表达量升高，例如前列腺素内过氧化物合酶2，并增加MDA及4-羟基壬烯醛的水平。也有研究发现，脂肪组织特异性GPX4基因敲除小鼠自发地出现葡萄糖不耐受、肝脏胰岛素抵抗和全身低度炎症^[12]。本研究结果表明，与对照组相比，db/db小鼠脂肪组织铁含量、MDA水平均显著升高，这提示2型糖尿病肥胖小鼠抗氧化应激能力降低，脂肪组织内铁超载。

维生素D是一种抗氧化剂和免疫调节剂，1，25（OH）₂D可通过下调脂肪细胞中炎症相关miRNA的表达限制代谢性炎症^[15]，同时通过抑制主要调控因子CCATT增强子结合蛋白-α、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ、C/EBP β和脂肪细胞蛋白2的表达，从而抑制脂肪生成^[16]。研究表明，低水平维生素D会增加内脏组织的脂肪堆积及机体慢性炎症反应^[17-18]，长期维生素D给药可显著降低高脂饮食诱导的小鼠体重增加，同时还能改善血脂代谢失调并增强胰岛素敏感性^[19]。本研究发现，在给予高剂量维生素D后2型糖尿病肥胖小鼠脂肪细胞体积变小，细胞排列较整齐。另外，维生素D也可通过显著降低丙二醛和超敏C反应蛋白的水平来降低氧化应激^[20-21]。DING等^[22]研究发现，1，25D/VDR通过下调叉头框蛋白O1的表达来抑制T2DM中的胰腺β细胞铁死亡。在维生素D缺乏症中，β细胞中过量的Ca²⁺和活性氧会导致细胞死亡并促进糖尿病^[23]，这进一步表明维生素D参与铁死亡过程。SLC7A11/GPX4轴被认为是预防铁死亡的主要抗氧化系统，在铁死亡过程中，SLC7A11和GPX4蛋白的水平显着降低^[24]。此外，TFR1和GSH可通过铁代谢和脂质代谢途径正向加速铁死亡^[25]。本研究结果显示，25（OH）D₃喂养充足后的db/db小鼠脂肪组织内铁含量、MDA水平降低，SOD、GSH水平升高，同时显著增加了GPX4、SLC7A11等铁死亡相关蛋白表达水平，表明维生素D提高了db/db小鼠脂肪组织抗氧化应激能力，减少脂质过氧化，减轻脂肪组织铁超载。

综上所述，2型糖尿病肥胖会导致脂肪组织发生铁超载，而高剂量维生素D给药降低了脂肪组织铁水平，改善了谷胱甘肽氧化还原状态，减轻db/db小鼠脂肪组织铁死亡。但其具体机制仍需进一步研究。

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基金资助

国家自然科学基金(81960160)

甘肃省自然科学基金(24JRRA1060)