IAV绝对定量PCR构建及其在体外感染巨噬细胞中的实验研究

摘要

目的：构建实时荧光定量PCR(RT-qPCR)绝对定量法检测甲型流感病毒（IAV），研究其在检测IAV体外感染巨噬细胞（Mφ）中病毒复制动态变化的应用效能。方法：佛波酯（PMA）诱导THP-1细胞刺激活化为Mφ，分为Mφ组和Mφ感染组[IAV的感染复数（MOI）为0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、15、20，共9个感染剂量组]。构建RT-qPCR绝对定量检测法检测IAV体外感染Mφ模型中细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数；CCK-8法检测24 h内不同MOI的流感病毒对Mφ细胞活性的影响，选取10～5～10～6TCID50的最佳MOI作为感染模型剂量；采用红细胞凝集实验（HA）检测感染模型细胞内和培养上清的病毒生物合成水平。结果：构建RT-qPCR的标准曲线为Y=-3.345X+38.454，具有良好的线性关系，检测下限为10～2copies/μL,10倍稀释梯度在10～3～10～8区分度和重复性良好；与Mφ组相比，随着MOI增加，Mφ活性下降（P<0.05），感染后贴壁Mφ形态出现变圆悬浮、胞质内大量颗粒、胞体模糊和细胞破裂等变化，且MOI越大，病变程度越严重；以105～106TCID50为依据，选取MOI=0.5、1、2、5、10作为Mφ体外感染的剂量；体外感染的细胞内和培养上清病毒核酸浓度随MOI增大而升高；Mφ感染组细胞内病毒标本HA效价均为1∶64，培养上清的HA效价在1∶32～1∶64。结论：构建RT-qPCR绝对定量法成功检测到体外感染Mφ细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数呈逐渐增加趋势，并与细胞病变程度呈正相关关系；HA结果无法准确区分病毒复制趋势，RT-qPCR绝对定量法的敏感度和区分度均较HA高。

关键词

荧光定量PCR / IAV / 巨噬细胞 / 体外模型