萤火虫荧光素酶标记的马尔尼菲篮状菌的构建与应用

摘要

目的：构建稳定表达萤火虫荧光素酶（Luc）的马尔尼菲篮状菌（TM），并进行生长状况和毒力的评估，为TM研究提供新手段和新工具。方法：构建Luc基因表达质粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-Luc，通过琼脂糖凝胶电泳和测序手段验证质粒是否携带Luc基因。采用农杆菌介导转化法将Luc插入TM基因组，在含有潮霉素培养基上筛选转化成功的TM转化子（TM-Luc）。于PDA培养基（27°C）中连续培养TM标准株ATCC18224和TM-Luc 14 d，记录二者的生长情况，挑取单个菌落进行乳酸酚棉蓝染色，荧光显微镜下观察两种菌株的形态。利用RT-qPCR和流式细胞术检测TM标准株和TM-Luc对THP-1来源巨噬细胞的杀伤情况。结果：经潮霉素筛选与电泳验证，得到稳定表达Luc的TM-Luc转化子。TM-Luc与荧光素底物结合后可发出荧光。在PDA培养基（27°C）连续培养14 d后，TM标准株菌落直径为（6.54±0.22）cm,TM-Luc菌落直径为（6.45±0.23）cm。两者表面均呈扁平绒毛状，并产生红色色素，生长曲线（P=0.273）与生长速率曲线（P=0.49）均无统计学差异（均P>0.05）。荧光显微镜镜下TM标准株和TM-Luc形态相似。流式细胞术显示TM标准株对THP-1来源的巨噬细胞杀伤作用较强于TM-Luc，在48 h时差异具有统计学意义（P=0.015 6），在72 h时差异无统计学意义（P=0.103 3）。炎症因子TNFA(24 h P=0.152 9,48 h P=0.111 5)与IL1B(24 h P=0.133 8,48 h P=0.692 1)在24 h、48 h表达差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论：TM-Luc与TM标准株形态学与功能学特征相似，可作为工具菌用于细胞感染和动物感染模型上，以便于更加直观地评估TM与宿主间的相互作用。

关键词

马尔尼菲篮状菌 / 萤火虫荧光素酶 / 标准株 / 农杆菌介导的转化