CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

甘暨; 杨丽超; 张起; 孙俊铭; 张俊; 何敏

doi:10.16190/j.cnki.45-1211/r.2023.02.001

广西医科大学学报 ›› 2023, Vol. 40 ›› Issue (02) : 173 -181. DOI: 10.16190/j.cnki.45-1211/r.2023.02.001

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

甘暨, 杨丽超, 张起, 孙俊铭, 张俊, 何敏

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摘要

目的：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法：在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列，构建2个CRISPR/Cas9重组载体；设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒；将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中，分离单克隆，提取基因组DNA，经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp；将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp，筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果：成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体；转染药筛后获得12个单细胞克隆，经测序，5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列；同源重组敲入效率为41.6%;p ALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆，经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞，敲除效率为60%。结论：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞，为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。