hCAFs的原代培养及其分泌蛋白聚糖谱探究

摘要

目的：研究人肝癌相关成纤维细胞（hCAFs）的原代培养及其分泌蛋白聚糖谱。方法：组织块贴壁法与酶消化联合组织块贴壁法进行hCAFs和正常成纤维细胞（NFs）的原代培养，观察两种方法对组织周围爬出细胞天数的影响；差速消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫印迹法（western blotting）、间接免疫荧光结合形态学观察对成纤维细胞进行鉴定；利用凝集素芯片检测hCAFs和NFs分泌蛋白聚糖谱。结果：与组织块贴壁法相比，酶消化法联合组织块贴壁法细胞爬出天数减少（P<0.01）；经纯化后hCAFs的胞体较大，胞体突起较多，而NFs胞体较小，胞体突起较少；两种成纤维细胞中均有FSP、FAP、α-SMA、Vimentin蛋白和mRNA的表达，而在hCAFs中表达较高（P<0.05）。hCAFs的分泌蛋白对CALSEPA、JAC、MPL、SSA、STL等5种凝集素的亲和性增强，而对IRA、IAA、PSA、CSA、GSL-IA4的亲和性减弱。结论：酶消化联合组织块贴壁法可加速细胞爬出，更适于原代培养成纤维细胞；通过比较hCAFs和NFs的分泌蛋白聚糖谱，提示T/Tn抗原、唾液酸、N-乙酰氨基葡萄糖结构在hCAFs的分泌蛋白中增加；而N-乙酰半乳糖胺和α-甘露糖的结构减少。

关键词

成纤维细胞 / 肿瘤微环境 / 凝集素芯片 / 分泌蛋白聚糖谱