CRISPR/Cas9系统介导的p53基因突变促进树鼩骨骼肌卫星细胞的增殖活性

摘要

目的：利用CRISPR/Cas9系统在树鼩骨骼肌卫星细胞中敲除p53基因并检测其增殖活性。方法：通过生物信息学方法对树鼩和15种哺乳动物的p53蛋白氨基酸序列进行同源性分析，根据树鼩基因组信息设计可编辑树鼩p53突变位点sgRNA，构建lenti CRISPR v2-sgp53基因编辑重组质粒，用293T细胞进行慢病毒包装，感染树鼩骨骼肌卫星细胞，嘌呤霉素筛选多克隆细胞并扩增；通过测序确定基因编辑效果。采用CCK8法检测细胞增殖活性，采用western blotting验证p53蛋白表达水平。结果：与人p53和小鼠p53氨基酸序列同源性（96.92%）相比，人p53和树鼩p53的氨基酸序列同源性（98.21%）更高。进化树分析显示，与小鼠相比，人与树鼩的亲缘关系更近。成功构建了3个靶向树鼩p53编辑的重组载体：lenti CRISPR v2-sgp53-g1、lenti CRISPR v2-sgp53-g2、lenti CRISPR v2-sgp53-g3，均成功在树鼩骨骼肌卫星细胞上实现p53基因编辑产生突变，导致p53功能丧失，p53的突变提高了树鼩骨骼肌卫星细胞的增殖能力。经药筛后的树鼩骨骼肌卫星细胞p53基因敲除成功，p53蛋白表达水平显著降低（P<0.01）。结论：本研究利用CRISPR/Cas9系统成功使树鼩骨骼肌卫星细胞p53基因突变、功能丧失，为后续树鼩p53基因敲除模型的建立提供了重要的分子生物学基础。

关键词

p53 / CRISPR/Cas9 / 树鼩 / 骨骼肌卫星细胞