眼镜蛇细胞毒素-1相互作用蛋白的网络毒理学筛选及体内外实验验证

摘要

目的：通过网络毒理学预测结合多维度实验，筛选并验证眼镜蛇细胞毒素（CTX-1）的关键互作蛋白，并构建小鼠皮肤坏死模型，结合组织病理学与免疫组化分析，初步探讨CTX-1同所筛蛋白作用后与皮肤坏死的关系。方法：首先通过SuperPRED数据库预测CTX-1的互作蛋白，采用韦恩图筛选互作蛋白与GeneCards数据库中的皮肤坏死相关蛋白的交集蛋白；应用STRING数据库进行蛋白互作网络分析；利用Cytoscape v3.10.0软件挖掘关键互作蛋白并选取一个进行实验验证；通过分子对接分析CTX-1与所选关键蛋白分子相互作用位点，并采用双分子荧光互补（BiFC）、表面等离子共振（SPR）实验对两者的相互作用进行体内外实验验证；将小鼠随机分为正常对照组和3个实验组（每组8只，雌雄各半），构建40μg、70μg、100μg浓度梯度的小鼠皮肤坏死模型，取小鼠皮肤组织进行组织病理学与免疫组化研究，统计分析各组小鼠皮肤组织中信号转导和转录激活因子3（STAT3）表达。结果：韦恩图结果表明CTX-1的潜在互作蛋白有48个，其中37个蛋白构成互作网络。从这些蛋白中挖掘到11个关键互作蛋白，并选取STAT3进行验证。分子对接结果显示STAT3与CTX-1的9个氨基酸形成11个氢键，构成二者的非共价作用。细胞内的BiFC实验初步证明了CTX-1与STAT3具有相互作用，体外的SPR实验得出CTX-1和STAT3的亲和力（KD）为4.327×10^-8 M，证明两者具有较强的相互作用。HE染色病理切片可见中、高浓度CTX-1组小鼠皮肤组织有明显的坏死与炎性细胞浸润。免疫组化染色结果表明3个实验组STAT3阳性面积比率均高于正常对照组，且中、高浓度组与正常对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：眼镜蛇咬伤后，毒液中的CTX-1进入机体后可能与STAT3相结合，进而引发一系列的生理生化反应，从而导致局部组织的肿胀和坏死。

关键词

眼镜蛇细胞毒素-1 / 蛋白互作 / 分子对接 / 表面等离子共振 / 双分子荧光互补