东方巴贝斯虫硫氧还蛋白过氧化物酶2基因克隆及表达

摘要

硫氧还蛋白过氧化物酶广泛存在于原核及真核生物中，是生物抗氧化系统的重要成员。该类酶通过半胱氨酸依赖的催化机制，在抵御氧化应激过程中发挥关键作用。在东方巴贝斯虫（Babesia orientalis）的cDNA及gDNA中克隆到硫氧还蛋白过氧化物酶2(BoTPx-2)基因。该基因开放阅读框（ORF）长度为771 bp，无内含子，编码257个氨基酸，预测蛋白分子量约为27.7 ku，等电点为8.86。其编码的氨基酸序列包含两个保守的半胱氨酸结构域Phe-Val-Cys-Pro和Glu-Val-Cys-Pro，分别位于第107位和第227位。生物信息学分析表明，该蛋白具有高度保守的催化结构域，属于PTZ00137超家族。通过将BoTPx-2与其他巴贝斯虫、泰勒虫及疟原虫的TPx-2序列进行比对及系统进化树分析，发现其与牛巴贝斯虫TPx-2(XM＿001609049)的亲缘关系最近，序列相似度达79.44%。利用同源重组方法构建重组表达质粒BoTPx-2-pE-sumo，该质粒包含1个His标签，编码364个氨基酸，分子量约为40 ku。经IPTG诱导后，重组蛋白以可溶性形式大量表达于上清。进一步的蛋白质免疫印迹（Western blot）结果显示，感染东方巴贝斯虫水牛阳性血清可特异性识别大小约40 ku的条带，与重组蛋白大小一致，表明BoTPx-2具有良好的免疫原性，可引起感染水牛产生相应的免疫反应。此外，利用BoTPx-2-pE-sumo重组蛋白制备的多克隆抗体，在东方巴贝斯虫全虫抗原中检测到一条约27 ku的特异性条带，与BoTPx-2的预期分子量相符，即为BoTPx-2的天然大小。研究结果成功鉴定并初步分析了东方巴贝斯虫TPx-2基因及其表达产物，为后续深入研究该虫的抗氧化机制提供理论基础。

关键词

硫氧还蛋白过氧化物酶 / 东方巴贝斯虫 / 半胱氨酸结构域 / 免疫原性