PK-15细胞中CRISPR/Cas9质粒与RNP复合物电转染条件的优化

徐倩倩, 赵梦, 朱梁, 徐蕴博, 刘忠华, 翁晓刚

doi:10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2026.04.005

东北农业大学学报 ›› 2026, Vol. 57 ›› Issue (4) : 48 -57. DOI: 10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2026.04.005

PK-15细胞中CRISPR/Cas9质粒与RNP复合物电转染条件的优化

徐倩倩, 赵梦, 朱梁, 徐蕴博, 刘忠华, 翁晓刚

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摘要

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein 9)基因编辑系统在生物学领域应用广泛，主要由Cas9蛋白和sgRNA(Single guide RNA)构成。将sgRNA/Cas9基因（蛋白）导入细胞的效率是影响基因编辑效率的重要因素之一。电穿孔转染技术因可操作性强、对细胞毒性作用小等一系列优点，在核酸与蛋白的细胞转染中广泛应用。影响电穿孔转染效率的因素包括脉冲电压、脉冲次数、脉冲时长、电转缓冲液与核酸（蛋白）浓度等，优化上述参数至关重要。研究在PK-15细胞系中探索各项转染条件，以期建立稳定、高效的sgRNA/Cas9质粒与RNP复合物电转染体系。结果表明：转染sgRNA/Cas9质粒最优条件为脉冲电压150 V、脉冲次数1次、脉冲时长15 ms,OPTI-MEM作为电转缓冲液、质粒浓度2μg Cas9-eGFP和4μg sgRNA时，PK-15细胞转染效率可达20.05%；转染RNP复合物最优条件为脉冲电压200V、脉冲次数1次、脉冲时长10 ms,OPTI-MEM作为电转缓冲液、RNP复合物浓度30 pmol Cas9蛋白和60 pmol sgRNA时，转染效率可达51.00%。