暗紫贝母甲羟戊酸激酶基因的重组表达与定点突变研究

摘要

目的 研究暗紫贝母Fritillaria unibracteata甲羟戊酸激酶(FUMK)基因的重组表达与定点突变。方法 基于暗紫贝母转录组中FUMK基因的ORF序列，全化学合成FUMK-pET28a重组质粒，在大肠杆菌BL21中表达其重组蛋白，纯化后检测其酶活性。利用定点突变验证关键氨基酸。结果 FUMK基因ORF全长为1158 bp,编码一条长度为385个氨基酸的多肽。FUMK与卷叶贝母的甲羟戊酸激酶(MK)同源性最高，序列相似性可达77.14%。FUMK与百合科贝母属植物的MK聚类形成单系群，具有最近的亲缘关系。在大肠杆菌BL21中成功表达出FUMK重组蛋白，纯化后的重组蛋白能够催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)与甲羟戊酸反应，形成甲羟戊酸磷酸。FUMK对ATP的酶促反应最大速度(V_(max))与米氏常数(K_m)值分别为1.72μmol·min~(-1)·mg~(-1)、15.84μmol·L~(-1);对甲羟戊酸的V_(max)与K_m值分别为0.71μmol·min~(-1)·mg~(-1)、28.58μmol·L~(-1)。His198Ala和Ser137Ala两种突变蛋白的酶促活性分别显著减少49.08%、23.91%,表明其是FUMK行使催化功能的关键氨基酸残基。结论 成功鉴定了FUMK基因，并验证了His198与Ser137两个关键氨基酸残基，为研究其基因在暗紫贝母甾体类生物碱生物合成途径中的生物学作用奠定了理论基础。

关键词

暗紫贝母 / 甲羟戊酸激酶 / 生物信息学分析 / 重组表达 / 定点突变 / 序列比对 / 催化反应 / 反应速率