植物乳杆菌NCU116中谷氨酸脱羧酶的挖掘及其酶学特性探究

摘要

谷氨酸脱羧酶（GAD）是生产γ-氨基丁酸（GABA）的关键限速酶，但细胞内酶系较为复杂使得其表达水平较低，微生物序列的基因组挖掘可以作为一种经济的策略来鉴定和生产具有良好性能和高活性的新型GAD。本文将植物乳杆菌NCU116的Lp GAD基因进行克隆，构建了重组质粒pET22b-Lp GAD，随后将其转化至大肠杆菌表达获得重组菌株E. coli BL21（DE3）-pET22b-Lp GAD，经诱导表达和分离纯化获得较高纯度Lp GAD。重组Lp GAD由467个氨基酸编码获得，为同源三聚体，分子质量为53.4 kDa，在278氨基酸位置有一个磷酸吡哆醛结合位点的保守赖氨酸，活性位点为213T和245D。酶学性质研究结果表明，重组Lp GAD在pH 5.0～5.5保持较高活性，在40～60℃时相对酶活较好，能在酸性和低温环境中保持较好的稳定性，K⁺对重组酶的催化活性具有促进作用。在pH 5.0和50℃条件下，谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸钠（MSG）脱羧生成GABA的反应动力学参数K_m、k_cat、k_cat/K_m、酶的比活力分别为26.95 mmol/L、1.29 s^-1、0.42 s^-1·mmol^-1·L、12.43 U/mg。

关键词

基因挖掘 / 基因工程 / 生物学分析 / 酶学性质 / γ-氨基丁酸 / 谷氨酸脱羧酶 / 植物乳杆菌