基于AIEgens增强的CRISPR/Cas12a荧光探针设计及在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用

摘要

研制了一种基于聚集诱导发光染料（aggregation-induced emission fluorogens, AIEgens）增强的荧光探针，建立了基于重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）结合CRISPR/Cas12a高灵敏检测单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）的新方法。利用阳离子AIEgens与双链DNA结合荧光极大增强的特性，构建了一种含双链以及单链DNA的探针。该探针5’末端携带一个荧光淬灭基团，双链DNA片段结合了多个AIEgens;利用crRNA可准确识别靶标序列并激活Cas12a反式切割活性的特点，切割荧光探针单链DNA产生荧光信号，从而实现LM高灵敏检测。将AIEgens增强型荧光探针与CRISPR/Cas12a结合，在无扩增情况下检测DNA片段的检出限为0.37 pmol·L^-1,灵敏度较传统荧光探针高40倍。将以上检测体系与RPA反应联用，检测LM的检出限为3×10～1 CFU·mL^-1;该方法检测人工污染LM的牛奶以及金针菇样本，批内以及批间平均回收率介于91.14%～108.47%,变异系数小于12.71%。构建了一种基于AIEgens增强的CRISPR/Cas荧光探针，极大地提高了基于荧光信号输出的CRISPR/Cas方法检测灵敏度，实现了食源性致病菌的高灵敏检测。

关键词

CRISPR/Cas12a / 聚集诱导发光分子 / 单核细胞增生李斯特菌 / 食源性致病菌 / 快速检测