反向DNA-pull down方法的建立

摘要

目的：建立反向DNA-pull down方法，验证目的蛋白与靶DNA的结合，为探究疾病发生发展的分子机制提供新的手段。方法：以小鼠骨髓来源巨噬细胞总cDNA为模板，通过PCR扩增获得转录因子PU.1-ETS结构域编码序列，通过酶切连接的方式连入表达质粒pET28a，转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导蛋白异源表达。以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR获得Ly96启动子序列。将异源表达的PU.1 ETS结合至Ni-NTA磁珠后，与靶DNA—Ly96启动子体外孵育，最终经蛋白酶K酶解、DNA抽提及琼脂糖凝胶电泳检测PU.1 ETS体外结合Ly96启动子情况，评估反向DNA-pull down技术的可行性。结果：通过大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得Ni-NTA磁珠-PU.1 ETS复合物，通过PCR获得Ly96启动子序列，经反向DNA-pull down验证PU.1 ETS与Ly96启动子的相互结合作用。结论：以PU.1-ETS-Ly96启动子相互作用为例，证实反向DNA pull-down技术的可行性，为探究已知蛋白与靶DNA结合和疾病发生发展分子机制提供了一种操作简单、实验条件要求不高、成本较低的可选方案。

关键词

蛋白-DNA结合 / 反向DNA-pull down方法 / 异源表达 / PU.1转录因子