Notch信号通路调控肌腱干细胞功能在肌腱病发生中的作用机制研究

摘要

目的：研究肌腱病发生中肌腱干细胞（tendon stem/progenitor cells,TSPCs）功能改变特征，探讨Notch信号通路在TSPCs功能失调中的调控机制。方法：将大鼠随机分为正常对照组、肌腱病组和N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯（DAPT）干预组，提取各组大鼠肌腱干细胞并传代培养；利用qRT-PCR和Western Blot实验分别检测各组TSPCs中Notch信号通路相关基因和蛋白表达；采用免疫组化法观察DAPT干预对肌腱病组织中炎症因子IL-6、COX2表达的影响；采用细胞克隆实验、EdU染色、PDT及CCK 8实验检测TSPCs增殖能力，划痕愈合及Transwell小室实验评估TSPCs迁移能力；采用免疫荧光实验测定TSPCs中SRY-box转录因子2(SRY-box transcription factor 2,SOX2)表达水平；对各组大鼠跟腱组织进行病理学检查。结果：Western Blot与qRT-PCR检测结果显示，相较于正常对照组，肌腱病组大鼠TSPCs中神经源性位点Notch同源蛋白1 (neurogenic locus notch homolog protein 1,Notch1)、锯齿状经典Notch配体1(jagged canonical Notch ligand 1,JAG1)、免疫球蛋白κJ区重组信号结合蛋白（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa j region,RBPJK）、Hes家族碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(hes family bHLH transcription factor 1,HES1)mRNA及蛋白水平均明显上升，差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞克隆实验、EdU染色、PDT实验及CCK 8实验结果均显示，肌腱病组TSPCs的增殖能力较正常对照组显著下降（P<0.05）,DAPT处理后能逆转肌腱病TSPCs的增殖能力。划痕实验及Transwell实验结果显示，肌腱病组TSPCs迁移能力较正常对照组显著降低（P<0.05）,DAPT干预后TSPCs迁移能力显著增强（P<0.05）。免疫荧光检测结果显示，与正常对照组比较，肌腱病组TSPCs中SOX2阳性细胞数量显著减少（P<0.05），提示其干性下降，而DAPT干预组SOX2阳性细胞数量较肌腱病组显著增加（P<0.05）。qRT-PCR结果显示，与正常对照组比较，肌腱病组TSPCs中成腱相关基因硬骨素（scleraxis,SCX）、神经上皮干细胞蛋白（neuroepithelial stem cell protein,NESTIN）、Ⅰ型胶原蛋白α1链（collagen type I alpha 1 chain,COL1A1）、腱调蛋白（tenomodulin,TNMD）表达水平显著降低（均P<0.05），而DAPT干预可逆转上述基因的表达下降（均P<0.05）。结论：肌腱病TSPCs中Notch信号通路异常激活，导致TSPCs增殖、迁移及分化能力下降，Notch信号通路抑制剂DAPT可明显恢复TSPCs增殖、迁移及分化能力，显著减轻肌腱组织的病理损伤程度，Notch信号通路有望成为治疗肌腱病的潜在靶点。

关键词

肌腱干细胞 / Notch信号通路 / N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸叔丁酯 / 肌腱病

基金资助

南通市科技计划-南通市关节疾病诊疗研究中心建设（HS2019004）