姜黄素通过上调circRNA＿SLC8A1表达促进小鼠的骨折愈合

摘要

目的 研究circRNA＿SLC8A1在姜黄素促进骨折愈合中发挥的作用，以及其潜在的作用机制。方法 采用RT-qPCR检测骨折患者和健康志愿者外周血中circRNA＿SLC8A1表达水平，以及姜黄素干预的成骨细胞MC3T3-E1中circRNA＿SLC8A1表达水平;采用star Base预测了miR-20b-5p分别与circRNA＿SLC8A1和死骨片1（Sequestosome 1,SQSTM1）结合，并通过荧光素酶报告基因分析进行验证。用0、5、10、20、40、80μmol·L^-1的姜黄素处理MC3T3-E1细胞72 h，用携带circRNA＿SLC8A1的腺病毒载体（sh-circRNA＿SLC8A1）、miR-20b-5p mimic、miR-20b-5p inhibitor、SQSTM1的过表达载体（OE-SQSTM1）、SQSTM1的小干扰RNA（si-SQSTM1）和所对应的空白对照转染MC3T3-E1细胞，分别采用CCK-8、Transw ell分析和流式细胞术检测细胞增殖、迁移和凋亡;采用ELISA检测caspase-3活性;采用Western blotting检测骨源性碱性磷酸酶（bone-specific alkaline phosphatase,BALP）和骨钙素（osteocalcin）的蛋白表达水平。除此之外，还构建了小鼠股骨骨折模型，检测建模后21 d小鼠股骨中circRNA＿SLC8A1的表达水平变化; Micro-CT分析观察小鼠股骨组织中骨体积（bone volume,BV）、骨小梁体积（trabecular bone volume,TV）和骨密度（bone mineral density,BMD）; H&E染色股骨组织切片，显微镜下观察记录骨面积和愈伤组织骨痂面积。结果 circRNA＿SLC8A1在骨折患者的外周血中的表达水平显著降低，在骨折小鼠的股骨组织中的表达水平在第7天时达到最低值，随后开始升高。此外，40μmol·L^-1的姜黄素处理MC3T3-E1细胞24 h无毒性，48 h后细胞活性降低，我们还发现姜黄素以剂量依赖诱导circRNA＿SLC8A1表达水平升高。沉默circRNA＿SLC8A1抑制MC3T3-E1细胞的增殖、迁移，诱导细胞凋亡，而姜黄素的处理逆转了这一影响。随后，我们通过验证发现miR-20b-5p能够分别与circRNA＿SLC8A1和SQSTM1结合，且circRNA＿SLC8A1通过充当miR-20b-5p的海绵上调SQSTM1的表达水平。miR-20b-5p inhibitor或OE-SQSTM1转染M C3T3-E1细胞，促进细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡和caspase-3活化。体内实验发现，骨折小鼠的BV/TV、BMD和骨面积显著减小，愈伤组织骨痂面积增大，股骨组织中circRNA＿SLC8A1、SQSTM1、BALP和osteocalcin的表达水平显著降低，miR-20b-5p的表达水平升高;而姜黄素处理增大了小鼠的BV/TV、BMD和骨面积，减小了愈伤组织骨痂面积，促进了股骨组织中circRNA＿SLC8A1、SQSTM1、BALP和osteocalcin的表达水平，抑制了miR-20b-5p的表达，高剂量姜黄素效果更佳;除此之外，注射携带circRNA＿SLC8A1过表达载体的腺病毒（Lv-circRNA＿SLC8A1）同样促进了小鼠的骨折愈合。结论 姜黄素抑制骨折小鼠股骨组织中circRNA＿SLC8A1的表达水平降低，经miR-20b-5p/SQSTM1轴加速骨折愈合。

关键词

姜黄素 / 骨折愈合 / circRNA＿SLC8A1 / MC3T3-E1细胞 / miR-20b-5p/SQSTM1轴