CRISPR/Cas9技术敲除细胞自噬相关因子(ATG7)对肝癌HepG2细胞功能的调控作用

摘要

目的 利用CRISPR/Cas9技术，构建靶向细胞自噬相关因子7(ATG7)的基因编辑质粒，建立ATG7稳定敲除的人肝癌HepG2细胞株，检测ATG7的调控作用。方法 利用http://crispr.mit.edu sgRNA在线设计工具设计靶向人ATG7的sgRNA序列，构建puro-Cas9-ATG7-sgRNA质粒并测序验证；构建的重组质粒通过转染的方式转入HepG2细胞；嘌呤霉素筛选获得ATG7稳定敲除的HepG2细胞株；Western印迹检测ATG7,自噬相关因子P62和LC3B的蛋白表达水平；CCK8实验检测细胞活性；免疫荧光技术分析DNA损伤标志物53BP1。结果 经测序验证，成功构建了靶向人ATG7的puro-Cas9-sgRNA质粒；经单克隆筛选，成功获得ATG7完全敲除的HepG2细胞株；ATG7缺失引起的自噬障碍导致DNA损伤加剧。结论 HepG2细胞中ATG7的缺失导致细胞自噬功能障碍，加剧了DNA损伤，同时促进HepG2细胞增殖，进而促进肿瘤的发生发展。

关键词

ATG7 / 细胞自噬 / DNA损伤 / 癌症