基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定

摘要

目的 采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁（DEAD-box RNA helicase 3X-linked, Ddx3x）肝脏条件性敲除小鼠。方法 设计特异的sgRNA序列，在Ddx3x基因外显子4～10两端插入LoxP序列，构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配，获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^Δhep)。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^Δhep基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^Δhep小鼠、Ddx3x^fl/fl小鼠，测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果 对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明，基因型符合Ddx3x^fl/fl;F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交，子代与Ddx3x^fl/fl小鼠杂交，即获得Ddx3x^Δhep小鼠；PCR与Western blotting结果显示，目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外，Ddx3x^Δhep小鼠无胚胎致死现象，出生后生理状况良好。正常饲养条件下，Ddx3x^Δhep小鼠与Ddx3x^fl/fl小鼠及野生型小鼠相比，血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^Δhep小鼠动物模型，为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。

关键词

CRISPR/Cas9技术 / Cre-LoxP系统 / Ddx3x / 肝脏条件性敲除小鼠

基金资助

国家自然科学基金项目(81770611、82002243); 北京自然科学基金和北京市教委联合资助重点项目(KZ202010025035); 首都卫生发展科研专项重点攻关项目(首发2020-1-1151); 北京市科技计划“首都临床诊疗技术研究及示范应用”专项课题(Z191100006619096、Z191100006619097); 北京市医院管理中心“青苗”计划专项经费资助(QML20201702); 北京市医管局“登峰”人才计划(DFL20221503); 高层次公共卫生技术人才建设项目(学科带头人-02-13)