脱氧胆酸诱导GERD大鼠食管Cajal间质细胞自噬模型的建立

摘要

目的 通过采用脱氧胆酸诱导大鼠食管Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajals, ICCs),建立胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)大鼠食管ICCs自噬模型。方法 原代分离、培养、免疫荧光鉴定大鼠食管ICCs,大鼠食管ICCs,将ICCs分为0μmol/L组、25μmol/L组、50μmol/L组、75μmol/L组、100μmol/L组，分别给予0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L浓度的脱氧胆酸诱导3 h;采用CCK-8检测不同浓度脱氧胆酸诱导后ICCs的活性，Western blotting检测LC3蛋白表达水平，计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，RT-PCR检测LC3B mRNA相对转录水平，普通显微镜观察ICC形态，透射电镜观察ICCs的超微结构，免疫荧光检测ICCs内的LC3及Beclin-1表达量。结果 食管ICCs免疫荧光鉴定平均阳性率92.15%,普通显微镜可见典型ICCs形态学表现；25μmol/L组、50μmol/L组、75μmol/L组、100μmol/L组的细胞活率分别为78.87%、76.43%、74.65%、72.60%;脱氧胆酸各浓度组的细胞活性率显著低于0μmol/L组(P<0.0001);25μmol/L组、50μmol/L组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白及LC3B mRNA表达水平高于0μmol/L组(P<0.01,P<0.05);75μmol/L组、100μmol/L组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白及LC3B mRNA表达水平低于25μmol/L组(P<0.05,P<0.001);100μmol/L组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白及LC3B mRNA表达水平低于75μmol/L组(P<0.01)。透射电镜下，与空白对照组比较，25μmol/L组ICCs细胞核固缩坏死，细胞器减少，细胞质内空泡增多，可见大量自噬体或自噬溶酶体。免疫荧光观察发现，25μmol/L组LC3及Beclin-1的平均荧光强度较空白对照组显著增强(P<0.01)。Western blotting检测发现，25μmol/L组Beclin-1及LC3蛋白表达水平较空白对照组显著升高(P<0.01),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于空白对照组(P<0.05)。结论 应用脱氧胆酸可成功建立GERD大鼠食管ICCs自噬模型，最佳诱导条件为25μmol/L浓度作用3 h。

关键词

胃食管反流病 / 脱氧胆酸 / Cajal间质细胞 / 自噬

基金资助

国家自然科学基金项目(82560908);国家自然科学基金项目(82260900、82574959); 广西自然科学基金项目(2025GXNSFAA069710、2026GXNSFAA00641081);广西自然科学基金项目(2024GXNSFBA010285、2021GXNSFBA196055); 国家中医药传承创新中心建设项目(2023019-05)