不同地区樟子松枯梢病林下土壤真菌多样性

Soil Fungal Diversity in the Understorey of Pinus sylvestris var.mongolica with Blight Disease in Different Regions

摘要

为探究健康樟子松天然林和不同地区樟子松枯梢病林下土壤真菌多样性差异，以红花尔基自然保护区樟子松健康天然林为对照，红花尔基自然保护区樟子松天然林、泰来县和章古台人工林中的感病樟子松为研究对象，采用lllumina Miseq高通量测序技术分析不同樟子松林地土壤真菌群落组成。结果表明，来自3个地区的4组樟子松林下土样中，总共获得 5 564个真菌扩增子序列变异体（Amplicon Sequence Variant，ASV），其中担子菌门（Basidiomycota）和子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度较高；不同地区不同土壤深度的优势属丰度及种类存在差异，健康天然林表层土壤真菌优势属为糙缘腺革菌属（Amphinema），0~10 cm和10~20 cm深土壤真菌优势属为丝膜菌属（Cortinarius）；感病樟子松林下土壤中，天然林表层、0~10 cm和10~20 cm深土壤真菌优势属分别为木霉属（Trichoderma）、篮状菌属（Talaromyces）和乳牛肝菌属（Suillus），泰来县人工林表层、0~10 cm和10~20 cm深土壤真菌优势属分别为Delastria属、假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）和Sagenomella属，章古台人工林表层土壤真菌优势属为Knufia属，0~10 cm和10~20 cm深土壤真菌优势属均为假裸囊菌属。此外，感病人工林土壤真菌群落中的植物病原菌占比分别为2.63%、5.04%，远低于感病天然林（8.77%）和健康天然林（8.11%）。人工林土壤真菌群落中的外生菌根含量低于天然林。推测人工林由于其树种的单一性导致外生菌根真菌丰富度较低，使得樟子松的抗病性较差。

Abstract

In order to investigate the differences in soil fungal diversity between healthy Pinus sylvestris var.mongolica natural forests and different areas of blight disease-susceptible P.sylvestris forests， this study used healthy natural forests of P.sylvestris in Honghuaerji Nature Reserve as the control， susceptible P.sylvestris in natural forests of Honghuaerji Nature Reserve， and in plantation forests in Tailai County and Zhanggutai as the study objects. The soil fungal community composition was analyzed using lllumina Miseq high-throughput sequencing technology. The results showed that 5 564 fungal Amplicon Sequence Variants （ASV） were obtained from the soil samples of 4 groups from three regions， with higher relative abundance of Basidiomycota and Ascomycota. The abundance and species of dominant genera varied in different soil depths in different regions. The dominant genus of soil fungi in the surface layer of healthy natural forests was Amphinema， and the dominant genus of soil fungi in the 0-10 cm and 10-20 cm depths was Cortinarius. In the understorey soil of susceptible P.sylvestris， the dominant genera of soil fungi in the surface layer， 0-10 cm and 10-20 cm depth of natural forests were the genera of Trichoderma， Talaromyces and Suillus， and the dominant genera of soil fungi in the surface layer， 0-10 cm and 10-20 cm depth of plantation forests in Tailai County were the genera of Delastria， Pseudogymnoascus and Sagenomella， and the dominant genus of soil fungi in the surface layer of Zhanggutai plantation forest was Knufia， while the dominant genus of soil fungi in the 0-10 cm and 10-20 cm depths were Pseudogymnoascus. In addition， the phytopathogenic fungi in the soil fungal community of the susceptible plantation forests were in the percentages of 2.63% and 5.04%， respectively， which were much lower than those of the susceptible natural forests （8.77%） and healthy natural forests （8.11%）. The content of ectomycorrhizal in the soil fungal community of plantation was lower than that of natural forest. It is hypothesised that plantation forests have a lower abundance of exogenous mycorrhizal fungi due to their monoculture， making P. sylvestris less resistant to disease.

Graphical abstract

关键词

高通量测序 / 樟子松 / 土壤微生物 / 枯梢病 / 真菌多样性

Key words

High-throughput sequencing / Pinus sylvestris var.mongolica / soil microorganisms / blight disease / fungal diversity

0 引言

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）是松科、松属常绿乔木^［1］。因其具有耐寒、耐旱、适应性强和生长快等特性，常用作防护林大面积栽植，是我国“三北防护林工程”和“治沙工程”建设的主要造林树种，在生态环境的建设上有着不可或缺的作用^［2］。近年来，随着人工林面积逐步扩大，全球气候变暖等因素，樟子松林地发生的病虫害日趋严重，其中松枯梢病对其危害尤为严重。樟子松枯梢病是由松球壳孢菌（Sphaeropsis sapinea）引起的寄主主导性病害^［3-5］，从樟子松幼苗至成林均可发病，其症状表现为顶芽枯死、枯针、枯梢或丛枝，可引起根茎腐烂，严重时可导致整株枯死^［6-8］。

多项研究表明，土壤微生物对土壤内的生态环境高度敏感，在调控生态系统功能上有着重要的作用。植物通过影响土壤环境，进而影响土壤真菌群落。病原菌侵染植物能够改变植株根际土壤微生物群落结构^［9-10］，土壤中某些微生物也可以有效增强植物的抗病性^［11］。本研究基于高通量测序技术对章古台和泰来人工林、红花尔基自然保护区天然林内的樟子松林下土壤真菌群落结构进行研究，通过对比土壤真菌多样性，明确不同地区感病樟子松人工林和健康樟子松天然林的土壤真菌群落差异，为樟子松枯梢病的防治提供支持^［13-14］。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

红花尔基自然保护区地处干旱半干旱地区的内蒙古呼仑贝尔市红花尔基自然保护区（47°36′~48°35′N，118°58′~120°32′E），属于寒温带大陆性气候，春秋季风大，夏季短暂，雨热同期，冬季漫长。

章古台人工林位于辽宁省彰武县章古台镇（42°43′~42°51′N，121°53′~122°22′E），属温带半干旱大陆性季风气候区。主要气候特点是干旱多风，年降水量500 mm左右，且多集中于6—8月，年蒸发量约为降水量的3倍。

泰来人工林位于黑龙江省西南部的齐齐哈尔市泰来县（46°13′~47°10′N，122°59′~124°E），属中温带大陆性季风气候，春季干旱多风，夏季高温少雨，秋季多风温差大，冬季寒冷少雪。

1.2 样品采集

在红花尔基自然保护区里选取3棵健康樟子松作为对照，在红花尔基自然保护区天然林、泰来县和章古台人工林中分别选取3棵感枯梢病樟子松。为样本具有代表性，在3棵不同树下采集同一深度的土壤（选取表层、0~10 cm和10~20 cm深土壤），每份样品3个重复，4组共36份样品。除去杂物、细根后，将土样装入无菌袋后置于干冰中，送到上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。具体样品编号见表1。

1.3 土壤真菌DNA的提取及数据分析

1.3.1 DNA的提取、PCR扩增及高通量测序

土壤真菌的DNA提取使用Omega soil DNA Kit试剂盒。为鉴定土壤样本中真菌种类，选取引 物ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）对标准真菌内转录间隔区ITS-1（a）区域进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，测序策略为PE250。下机数据利用DADA2方法^［15］进行去引物、质量过滤、去噪（denoise）、拼接和去嵌合体等步骤。进行去重（dereplication）后产生的每个去重的序列为ASVs （amplicon sequence variants）。DNA的提取、PCR扩增及高通量测序工作委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成。

1.3.2 数据分析

将处理后的真菌ASVs与UNITE数据库（Release 8.0，https：//unite.ut.ee/）进行比对，根据比对结果对每个真菌ASV进行界、门、纲、目、科、属、种各个水平下的物种分类学注释，统计每个分类单元下的ASV数量或丰度，进而分析样本的真菌群落门类组成。通过层次聚类树图、样本与物种丰度circos图及共有属在不同样本中的占比，展示样本间的异同。生境内多样性（within-habitat diversity，Alpha）是指局部均匀生境下的物种在丰富度（richness）、多样性（diversity）和均匀度（evenness）等方面的指标。生境间多样性（between-habitat diversity，Beta）是指生物多样性在空间或环境梯度上的变化。利用Alpha多样性及Beta多样性完成土壤真菌群落多样性分析。

基于上海派森诺基因云平台（https：//www.genescloud.cn）进行生物信息学分析。真菌ASV韦恩图及Beta多样性的PCoA图由R语言工具绘制，Alpha多样性中各种指数由QIIME2（2019.4）分析获得，利用origin2022绘制实现可视化。真菌生态功能群划分采用FUNGuild预测工具将高通量测序获得的真菌ASV上传分析。

2 结果与分析

2.1 土壤真菌ASV聚类分析

测序结果去噪后，绘制出真菌ASV的Venn图。由图1可知，4组样本中一共获得5 564真菌ASV， 共有真菌ASV数为32个。健康樟子松林下土壤 样本C组特有真菌ASV数为779个。3组感枯梢病樟子松林下土壤样本中，G组特有真菌ASV最多，为1 658个；而D组特有真菌ASV最少，仅有953个。此外，C组、D组、E组、G组总真菌ASV数分别为 1 027、1 393、1 887和2 089个。

2.2 土壤真菌群落门类组成

将不同样品中相同的真菌进行合并后，制成各水平微生物分类单元数统计表，见表2。由表2可知，4组样本中均为表层土壤真菌种类数量最多，感病人工林与天然林土壤真菌种类数量高于健康天然林土壤真菌，而感病人工林土壤真菌种类数量低于感病天然林土壤真菌。

由图2可知，在3个不同土壤深度下，C组的优势门均为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉门（Mucoromycota）；D、E、G组的优势门均为子囊菌门、担子菌门、被孢霉门（Mortierellomycota）。这些结果表明，在门水平下感病的样品土壤真菌群落基本相同。与健康天然林对比，感病样本土壤中担子菌门相对丰度显著降低，子囊菌门相对丰度显著升高。

由图3可知，假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）在G4-6、G7-9、D4-6中为相对丰度最高的属，分别占43.13%、44.02%和18.29%；木霉属（Trichoderma）在E1-3中相对丰度最高，约9.18%；篮状菌属（Talaromyces）在E4-6中相对丰度最高，为18.25%；乳牛肝菌属（Suillus）在E7-9中相对丰度最高，为10.64%；Delastria属在D1-3中相对丰度最高，为48.88%；Sagenomella属在D7-9中相对丰度最高，为37.10%；Knufia属在G1-3中相对丰度最高，为15.14%；糙缘腺革菌属（Amphinema）在C1-3中相对丰度最高，为17.9%；丝膜菌属（Cortinarius）在C4-6和C7-9中相对丰度最高，分别为16.98%和26.82%。

2.3 土壤真菌群落组成差异与相似性

层次聚类树图中，样本根据彼此之间的相似度聚类，样本间的分支长度反映样本间的相似度。由图4可知，各组样本中的重复处理均分别聚为一支，证明不同地点各处理组内样本真菌的组成与丰度较相似；C组3个处理组间分支长度短，D1-3、G1-3聚类为一支，与D4-6、D7-9、G4-6、G7-9的聚类间分支长度较长。结合图中右侧堆叠柱状图可知，健康天然林不同深度土壤真菌的组成及丰度较相似，感病人工林表层与0~10、10~20 cm土壤真菌的组成及丰度具有一定差异，且子囊菌门（Ascomycota）在所有样本中的相对丰度都较高。

由表3可知，C组和E组的土壤真菌Top20属中有10个共有属，这些共有属在C内占比0.543 9，在E内占比0.460 2。对比E、D、G组土壤真菌的Top20属中有9个共有属（表4），该共有属在E、D、G组中分别占比0.354 3、0.338 4、0.532 9。樟子松天然林中，共有属在感病樟子松土壤内占比高于健康樟子松土壤。

基于分类学组成分析并结合图4、表3和表4，将C、D、E、G这4组Top20属中的各属真菌相对丰度进行比较，结果显示，镰孢霉属（Fusarium）为D、E、G组共有属；C组的外生菌根菌（Ectomycorrhizal fungi， ECMF）类型有丝膜菌属、白齿菌属（Sistotrema）、糙缘腺革菌属、棉革菌属（Tomentella）、红菇属（Russula）、丝盖伞属（Inocybe）、牛肝菌属和空团菌属等，相对丰度约为39%；E组的ECMF种类较C组少，相对丰度为25.36%；D组只包含3种ECMF，相对丰度为1.4%，G组中仅有一种糙缘腺革菌属（Amphinema）为ECMF，相对丰度0.28%。这些结果说明，天然林土壤真菌中含有较高的外生菌根菌，而人工林中外生菌根菌较少。

通过Circos图来表现样本与物种丰度的相互关系，以属（genus）水平进行绘图，可以看出各样本中不同物种所占的比例及某一物种在不同样本中的比例关系。由图5可知，糙缘腺革菌属在D组不存在，白齿菌属在G组不存在。由表3和表4可知在属水平上，各地点真菌组成略有区别，且相对丰度在各样本中存在差异。如青霉属（Penicillium）在C区15.0%，在D区9.4%，在E区6.74%，在G区10.1%。

2.4 土壤真菌群落多样性分析

2.4.1 Alpha多样性

Shannon指数值越高，表明群落的多样性越高。Good’s coverage指数越高，则样本中未被检测出的物种所占的比例越少。Chao1指数越大，表明群落的丰富度越高。4组土样中真菌覆盖率（coverage）均超过99.78%，表明真菌的测序深度已达到较高水平，数据可靠，如图6所示。

由图6（b）可知，对比同一地点不同深度的Shannon指数，C组表层指数最高，10~20 cm指数最低；D组中0~10 cm指数最高，10~20 cm指数最低；E组为表层指数最高，0~10 cm指数最低；G组为表层指数最高，0~10 cm指数最低。对比不同地点同一深度的Shannon指数，表层最高为E组，最低为D组；0~10 cm最高为D组，最低为G组；10~20 cm最高为E组，最低为D组。

由图6（c）可知，4组样本表层Chao1指数最大为G组，最小为D组；0~10 cm最大为E组，最小为C组；10~20 cm中最大为E组，最小为C组。C组3个处理中Chao1指数从大到小依次为C1-3、C7-9、C4-6；D组3个处理中Chao1指数从大到小依次为D4-6、D1-3、D7-9；E组3个处理中Chao1指数从大到小依次为E1-3、E7-9、E4-6；G组3个处理中Chao1指数从大到小依次为G1-3、G7-9、G4-6。

2.4.2 Beta多样性

主坐标分析（Principal Coordinate Analysis，PCoA）可以通过观察数据点在主成分空间中的分布情况，帮助分析理解各样本之间的关系。数据点聚集或分散，表明其之间存在相似性或差异性。

由图7和图8可知，E1-3、E4-6、E7-9距离近，真菌群落构成差异较小，其他数据点与之距离较远，真菌群落构成差异较大。D4-6与D7-9，G4-6与G7-9两两之间距离近，真菌群落构成差异小。即同为感病樟子松林，人工林与天然林之间的真菌群落构成差异较大，同一人工林0~10 cm与10~20 cm深土壤真菌群落之间构成差异较小。C1-3、C4-6与C7-9远离其他数据点，健康天然林与其他感病林之间土壤真菌群落构成具有差异性。

2.5 樟子松土壤真菌生态功能群

基于FUNGuild数据库解析，除去未鉴定类群和复合型类群，4组土样中土壤真菌可分为3种营养模式和10个生态功能群，见表5。

在各土样中真菌优势营养型均为腐生营养型真菌。腐生营养型真菌在C组占46.36%，E组占45.55%，D组占74.62%，G组占70.10%。说明腐生营养型真菌在人工林中占比较大，在天然林中占比较少。病理营养型真菌在C组中占16.20%，E组中占24.62%，D组中占8.36%，G组中占16.56%，即病理营养型真菌在感枯梢病樟子松天然林中占比最大。共生型真菌在C组占比约为36.75%，在E组占29.78%，在D组占16.95%，在G组占13.2%。表明共生营养型真菌在天然林占比大于人工林占比，而共生营养型真菌在健康樟子松天然林中占比大于感枯梢病樟子松天然林。

3 讨论

本研究通过Illumina MiSeq测序平台，对健康樟子松天然林和不同地区感枯梢病樟子松林下土壤真菌进行了分析，用数据说明上述地区之间土壤真菌多样性和群落组成的差异。关于植物感病对土壤微生物群落的影响，在以往的多种作物研究中曾发现^［15-17］，植物感病可以导致土壤中真菌数量明显增加。而本研究中也得到了相同的结论，感病樟子松土壤真菌ASV数对比健康樟子松土壤真菌ASV数有明显增加。

本研究发现，樟子松林下土壤真菌中子囊菌门和担子菌门是主要类群，子囊菌门大多数为腐生菌，可以分解难降解性有机质。担子菌门腐生或寄生，在潮湿的土壤中分解木质纤维素，作为主要分解群落在土壤中存在^［18］。此外，在健康樟子松林下毛霉门相对丰度同样较高。毛霉门真菌在自然界中分布广泛，腐生于土壤、动物粪便和动植物残体等基物中，或寄生于动植物甚至其他真菌（包括其他毛霉门真菌）中^［19］。感枯梢病樟子松林下土壤真菌中还有被孢霉门占比较大，被孢霉门在分解植物凋落物方面有着重要作用^［20-21］。

樟子松林下土壤真菌的营养模式分为腐生营养型、共生营养型以及病理营养型3种^［22］。本研究中，感枯梢病樟子松天然林中共生营养型真菌占比较大，其中外生菌根为主要类群。共生营养型真菌通过和植物两者共生的生态学机制增强寄主植物的抗逆性，减轻有害生物危害，提高寄主植物对生境的适应能力^［23］。此外，腐生营养型真菌在各样本中占据主要地位，其在养分循环方面具有重要作用^［24］。以往的研究表明，腐生营养型真菌与土壤有机质含量有关^［25-26］，因此接下来的研究可以着重分析感枯梢病樟子松林下土壤的理化性质与腐生营养型真菌的关系。

外生菌根是土壤真菌和植物根系之间形成的共生关系，有利于宿主物种抵抗非生物或生物胁迫，还可以提高植物的抗病能力，促进植物生长^［27］。树种多样性增加可以显著降低病原性真菌的数量及丰富度，增加外生菌根的丰富度，树种组成改变外生菌根的真菌群落结构，对森林生态系统功能产生积极影响^［28］。本研究数据表明，章古台感病人工林土壤真菌中外生菌根占比最低，仅为1.43%，其次为泰来县感病人工林中占11.27%。由于其单一的树种组成，导致外生菌根的丰富度低。病理营养型真菌中植物病原菌生态功能群在感病人工林土壤真菌群落占比分别为2.63%、5.04%，远低于健康天然林（8.11%）。推测人工林树种的单一性导致外生菌根丰富度低，樟子松对生境的适应能力弱，抗病性较差，更易患病。

4 结论

本研究以健康樟子松天然林和不同地区感枯梢病樟子松林林下土壤为研究对象，利用高通量测序技术，分析樟子松天然林及人工林土壤真菌群落结构组成的多样性和差异，得到以下研究结果。1）来自3个地区的4组樟子松林下土样中，总共获得 5 564个真菌ASV，其中担子菌门和子囊菌门的相对丰度较高。2）在不同立地条件下、不同深度土壤中，真菌群落的结构组成具有差异性。3）病理营养型真菌中植物病原菌生态功能群在章古台和泰来感病人工林土壤真菌群落分别占2.63%、5.04%，在健康天然林中占8.11%，感病天然林中占8.77%。4）章古台感病人工林土壤真菌中外生菌根占1.43%，泰来县感病人工林中占11.27%，健康天然林中占30.73%，感病天然林中占16.17%。

本研究结果表明，不同立地条件下樟子松林下土壤真菌群落的组成存在差异，明确了枯梢病的发生对樟子松林下土壤微生物群落结构有一定影响，人工林树种的单一性导致外生菌根丰富度低，樟子松人工林抗病性较差，更易患病。

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基金资助

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572022DS07)