偃松体细胞胚胎发生与遗传转化技术体系的建立

Establishment of a Technical System for Somatic Embryogenesis and Genetic Transformation in Pinus pumila

摘要

以偃松（Pinus pumila）未成熟种子为材料，未成熟合子胚为外植体，道格拉斯冷杉培养基（douglas Fir medium，DCR）为基本培养基，通过调节植物生长调节剂6-BA、NAA和ABA的质量浓度诱导其体细胞胚胎发生，共获得3个胚性细胞系。基于体胚发生体系，经过卡那霉素质量浓度筛选、侵染时间、共培养时间确定，最终建立适用于偃松的农杆菌介导的遗传转化体系，利用该系统成功获得偃松的抗性愈伤。结果表明，偃松体胚发生体系包括未成熟种子消毒、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织增殖、体胚诱导、萌发后培养及生根培养6个阶段。胚性愈伤组织诱导最适培养基DCR+1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA，诱导率为1.11%；胚性愈伤组织增殖最适培养基为DCR+0.35 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖倍数为3.73；体胚诱导最适培养基DCR+20 mg/L ABA，每克胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生量平均为86.67；体胚萌发后使用DCR+活性炭培养基进行生根诱导，生根率为58%；体胚生根后培养最适培养基为木本植物培养基（woody plant medium，WPM）+ 0.1 mg/L IBA。遗传转化最适卡那霉素质量浓度为60 mg/L，最佳侵染时间为15 min，最佳侵染液菌体密度OD₆₀₀为0.4，经7 d恢复培养后，再将组织转接于含60 mg/L的卡那霉素的培养基进行筛选和愈伤增殖诱导，经DNA水平鉴定和β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase，GUS）组织化学染色验证，成功获得了转基因愈伤组织，初步建立了偃松的遗传转化体系。

Abstract

Immature zygotic embryos from immature seeds of Pinus pumila were used as explants， with DCR as the basal medium. Somatic embryogenesis was induced by adjusting the concentrations of plant growth regulators （6-BA， NAA， and ABA）， leading to the acquisition of 3 embryogenic cell lines. Based on this somatic embryogenesis system， an Agrobacterium-mediated genetic transformation system suitable for P. pumila was finally established through the determination of kanamycin selection concentration， infection time， and co-cultivation duration， and resistant calli of P. pumila were successfully obtained using this system. The results indicated that the somatic embryogenesis system of P. pumila included 6 stages： disinfection of immature seeds， induction of embryogenic callus， proliferation of embryogenic callus， induction of somatic embryos， post-germination culture， and rooting culture. The optimal medium for embryogenic callus induction was DCR+1 mg/L 6-BA+2 mg/L NAA， with an induction rate of 1.11%； the optimal medium for embryogenic callus proliferation was DCR+0.35 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA， achieving a proliferation multiple of 3.73； the optimal medium for somatic embryo induction was DCR+20 mg/L ABA， with an average of 86.67 somatic embryos per gram of embryogenic callus； after somatic enbryos post-germination， DCR+activated carbon was used for root induction， resulting in a rooting rate of 58%； and the optimal medium for rooting culture was WPM+0.1 mg/L IBA. For genetic transformation， the optimal conditions were a kanamycin concentration of 60 mg/L， an infection time of 15 minutes， and an Agrobacterium suspension concentration of OD₆₀₀ is 0.4； after 7 days of recovery culture， the tissues were transferred to a medium containing 60 mg/L kanamycin for selection and callus proliferation induction. Through verification by DNA-level identification and GUS histochemical staining， transgenic calli were successfully obtained， and a genetic transformation system for P. pumila was initially established.

Graphical abstract

关键词

偃松 / 体细胞胚胎发生 / 遗传转化 / 农杆菌介导转化 / 胚性愈伤组织 / 离体再生 / 卡那霉素筛选 / GUS组织化学染色

Key words

Pinus pumila / somatic embryogenesis / agrobacterium-mediated transformation / embryogenic callus / plant regeneration in vitro / kanamycin screening / GUS histochemical staining / genetic transformation

0 引言

松属（Pinus）是裸子植物中最大的属^［1］，同时也是加工制造木材、纸浆、松香和松节油的主要原料来源^［2］，是现存最古老的针叶树之一^［3］。偃松（Pinus pumila）属松科（Pinaceae）松属五针松组植物，广泛分布于亚高山地带，是高山林线的重要组成部分，在北半球具有多样的生境条件^［4］。在我国大兴安岭地区，偃松作为寒温带针叶林偃松矮曲林的绝对建群种，是高海拔生境水土保持生态屏障的重要组成部分，同时也是研究寒温带极端生境适应机制的典型样本，既能补充区域生物多样性垂直梯度，也能维持群落稳定性与大兴安岭生态系统完整性^［5］。在天然林保护工程中被列为水土保持林，属于生态公益林中的重点树种，同时偃松也是药用和食用的重要经济树种^［6］。目前，偃松已经成为林区产业转型带动百姓脱贫致富的重要经济林树种^［7］。但是在自然生境下偃松分布零散、群落规模较小，种质资源未被收集，种子萌发率低、萌发时间不一致，严重影响了偃松资源的保护和开发利用^［8］。

传统松属植物育种一般通过良种选育或选择优良无性系开展种内和种间杂交^［9］。然而，松属植物遗传背景复杂，传统育种方法周期长，繁殖效率低且子代分化严重，易导致理想特征的分离，制约了松属植物规模化推广应用和品种改良^［10］。与阔叶树相比，针叶树往往幼年期更长、基因组巨大且复杂，通过传统育种方法进行遗传改良非常耗时^［11］，因此，建立松树的再生体系和遗传转化体系对松树育种具有重要意义。

体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis）是指植物体细胞在离体培养条件下，经历与合子胚类似的发育途径，最终形成完整植株的过程^［12］。目前，已有近30种松属植物通过体胚发生途径建立了离体再生体系^［13］。美国的火炬松、湿地松和新西兰辐射松已成功获得体胚苗并应用于实践生产中^［14］。国内研究者以成熟、未成熟合子胚为外植体，成功构建了马尾松（P.massoniana）^［15］、赤松（P.densiflora）^［16］、火炬松（P.taeda）^［17］和油松（P.tabuliformis）^［18］等松属植物的体细胞胚胎发生体系。2014年，俄罗斯科学院首次使用偃松种子为外植体，在含有激素2，4-D和6-BA的1/2利特维培养基（litvay medium，LV）培养基成功诱导了偃松的胚性愈伤组织（诱导率为0.4%），并且通过植物组织培养获得了完整的偃松苗^［19］。在遗传转化方面，松树的遗传转化体系仍处于探索阶段。在20世纪90年代，欧洲落叶松（Larix decidua）通过农杆菌介导法获得了针叶树种的首例转基因植株，随后火炬松、辐射松、海岸松和兴安落叶松等多个松树树种均利用农杆菌介导法或基因枪法进行了遗传转化方面的研究^［20］。截止目前，只有火炬松、湿地松、油松和海岸松等少数松属树种建立了稳定的遗传转化体系，转化效率仍有待提高^［21］。

本研究旨在以偃松未成熟合子胚为外植体，建立并优化其体细胞胚胎发生的各阶段培养条件，并在此基础上，以胚性愈伤为材料探索并建立农杆菌介导的偃松遗传转化体系，为偃松优良种质实现规模化繁育及遗传改良初步奠定理论与技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

采集偃松球果来自大兴安岭呼中林业局生长健康、无病虫害的母树，采集时间为2024年7月16日。将采集的球果储存于冰盒中运输至实验室，保存在4 ℃环境中。在超净工作台中，用无菌镊子剥开球果鳞片，取出未成熟种子，剔除空瘪或有机械损伤的种子，选取饱满、种皮光滑的种子备用。遗传转化材料为以偃松未成熟合子胚为材料成功诱导出的胚性愈伤组织，优化继代条件后增殖培养15 d，选取生长状态良好的2^#胚性细胞系愈伤组织作为试验材料。

试验所需试剂如下：道格拉斯冷杉培养基（douglas Fir medium，DCR）（Phytotech）、木本植物培养基（woody plant medium，WPM）（Phytotech）、麦芽糖（Phytotech）、硫酸卡那霉素（Phytotech）、蔗糖（西化）、琼脂（BioFroxx）、结冷胶（Duchefa Biochemie）、酵母提取物（Oxoid）、胰蛋白胨（Oxoid）和肌醇（Biotop）等。

1.2 DNA的提取及转化愈伤鉴定

取野生型（wild type，WT）和侵染后愈伤组织，用无菌滤纸吸干表面水分，放入液氮中快速冷冻，转入预冷的研钵中，加入少量液氮，快速研磨至粉末状，利用DNA提取试剂盒（Qiagen）进行DNA的提取，方法参照试剂盒说明书，由此获得DNA，以表1中引物进行PCR扩增鉴定，GUS（β-Glucuronidase）为β-葡萄糖苷酸酶。利用抗性愈伤组织的总DNA作为模板，以野生型胚性愈伤组织为阴性对照，载体质粒为阳性对照，在分子水平上对筛选出的胚性愈伤组织进行检测。

1.3 GUS染色方法

在超净台中将整个阳性胚性愈伤放入15 mL离心管，标记对应编号。取一朵野生型胚性愈伤作为对照，加5 mL 90%的丙酮固定20 min，倒出固定液，加5 mL GUS染液清洗管内残留丙酮，重复一次。将离心管用铝箔纸覆盖，加5 mL GUS染液，置于冰上抽真空30 min左右（愈伤组织沉入底部），37 ℃避光放置16 h。最后吸出GUS染液，加5 mL脱色液，每30 min更换一次脱色液，直至对照的野生型愈伤组织变为白色。

GUS染液：依次称取2.922 4 g乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、38.012 g磷酸钠、0.658 5 g铁氰化钾、0.844 8 g亚铁氰化钾，加入1 mL 曲拉通X-100（Triton X-100），定容至1 L后，将溶液pH调节至7.0，最后向其中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷（X-Gluc）粉末（终质量浓度为1 mg/mL），混匀得到GUS染液。

脱色液：取750 mL无水乙醇与250 mL冰醋酸混合，配制成脱色液。

2 结果与分析

2.1 偃松体胚发生体系

2.1.1 未成熟种子消毒

取偃松未成熟种子，置于75%乙醇中充分消毒3 min，再经5%次氯酸钠充分消毒8 min，随后利用灭菌水充分清洗3次，将消毒处理后的材料放置在无菌培养皿内，用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，用无菌手术刀纵向划破胚乳至胚后，用镊子小心将其分开，获得偃松完整合子胚，并接种于胚性愈伤诱导培养基中，见图1。

2.1.2 胚性愈伤诱导培养基筛选

根据前期预试验及松属植物体胚发生研究经验，以偃松未成熟合子胚为外植体，以DCR作为基本培养基（DCR+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L酸水解酪蛋白+0.5 g·L^-1谷氨酰胺，pH=5.8），挑选不同植物生长调节剂6-BA、NAA诱导偃松的胚性愈伤，细胞分裂素6-BA质量浓度保持不变（1 mg/L），生长素NAA设置不同质量浓度（0.5、1、2 mg/L）。每个处理10个培养皿，每个培养皿接种9个外植体，每个处理重复3次，接种30 d后统计胚性愈伤的诱导率。

愈伤诱导率=诱导出明显愈伤的外植体数量/接种时全部外植体数量×100%。（1）

在接种30 d后统计发现，仅处理1诱导获得3个胚性细胞系，而处理2和处理3未诱导出任何愈伤组织，见图2（a）和表2。这一结果表明，当生长素与细胞分裂素的质量浓度比为2∶1时，更有利于偃松合子胚的脱分化及胚性细胞的形成。进一步对3个胚性细胞系进行体胚诱导能力检测发现，2^#细胞系的体胚发生能力最强，见图2（b）。后续试验均选用该细胞系作为材料，以保证试验结果的稳定性。

2.1.3 胚性愈伤增殖培养基筛选

将诱导出的质量约0.2 g初代愈伤细胞团接种到含细胞分裂素6-BA（0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mg/L）和生长素NAA（1、0.5 mg/L）共5个处理的DCR基本培养基（DCR+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L酸水解酪蛋白+0.5 g/L谷氨酰胺，pH=5.8）中进行愈伤增殖诱导。每个处理接种3个培养皿，每个接种9个胚性愈伤，每个处理重复3次，接种15 d后统计胚性愈伤的增殖倍数，见表3和图3。

胚性愈伤增殖倍数=增殖后的胚性愈伤鲜质量/接种时愈伤质量。（2）

综合所有处理组的情况可以得出，植物生长调节剂6-BA和NAA的质量浓度组合对愈伤增殖倍数有着显著影响。其中，当6-BA质量浓度为0.35 mg/L且NAA质量浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织的增殖效果最佳，该质量浓度组合为愈伤组织的增殖提供了较为适宜的条件（表3）。

2.1.4 体胚诱导培养基筛选

将增殖培养15 d质量约0.2 g的愈伤组织接种到含有相同质量浓度ABA（30 mg/L）的DCR成熟培养基（DCR+40 g/L麦芽糖+8 g/L结冷胶+0.1 g/L肌醇+ 0.5 g/L酸水解酪蛋白，pH=5.8）和基础培养基（basal medium，BM）（BM母液+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L酸水解酪蛋白+0.5 g/L谷氨酰胺，pH=5.8）培养基中诱导体胚，共2个处理，每个处理接种3个培养皿，每个培养皿接种5朵愈伤。试验结果发现，DCR成熟培养基在60 d左右出现体胚，90 d出现大量体胚，而BM培养基在120 d左右才出现少量体胚。因此，确定DCR成熟培养基相比于BM成熟培养基更适合诱导体胚发生，见图4。

确定体胚诱导基础培养基后，采用L₉（3³）正交试验设计开展体胚诱导培养基具体条件的筛选，试验涉及的因素包括麦芽糖、ABA和结冷胶的质量浓度，每个因素均设3个水平，按正交试验设计进行试验，重复3次，放置于常温黑暗环境下培养，于90 d后统计体胚发生数量，见表4和图5。结果表明，处理7培养基的培养条件可以诱导产生数量最多的体胚。

体胚发生数量=每种处理诱导的体胚总数/接种培养皿愈伤组织总质量。（3）

2.1.5 萌发后培养及生根培养

参考湿地松×加勒比松杂交种未成熟合子胚诱导体细胞胚胎发生体系^［22］，对偃松体胚萌发体系进行尝试探索。将在成熟培养基中发育成熟的子叶型胚接种到能提供接近土壤环境的活性炭（2 g）DCR培养基（DCR+25 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L酸水解酪蛋白，pH=5.8）中，每个培养皿接种5个体胚，共接种10个培养皿，见图6（a）。暗培养7 d进行体胚萌发诱导，暗培养后发现体胚明显伸长，见图6（b）。然后，放置于光照条件下继续培养，15 d后约有58%的体胚出现胚根伸长的现象，见图6（c）。随后将胚根伸长的体胚转移到含有生长素IBA（0.1 mg/L）的WPM培养基（WPM+25 g/L蔗糖+5 g/L琼脂，pH=5.8）中，置于光照条件下继续培养，使其保持正常的生长状态，见图6（d）。6个月后针叶伸长舒展，同时胚根伸长并生长出侧根，生长状态良好，见图6（e）。

体胚生根率=生根的体胚数量/总接种体胚数量。（4）

2.2 偃松遗传转化体系的初步研究

2.2.1 卡那霉素质量浓度筛选

为了确定农杆菌介导的遗传转化过程中卡那霉素的适宜质量浓度，在含有不同质量浓度梯度（0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L）卡那霉素的最佳愈伤增殖培养基中对偃松胚性愈伤组织进行卡那霉素敏感性的测定，共8个处理，每个处理接种3个培养皿，每个培养皿接种9朵质量为0.2 g的愈伤组织，每个处理重复3次。接种15 d后，观察每个处理中愈伤组织的增殖情况并统计增殖倍数（表5）。

胚性愈伤增殖倍数＝增殖后的胚性愈伤鲜质量/接种时愈伤鲜质量。（5）

结果表明，随着卡那霉素质量浓度不断升高，偃松胚性愈伤组织的增殖倍数呈现下降趋势（表5）。不添加卡那霉素的偃松胚性愈伤组织15 d的增殖倍数为3.75，当卡那霉素质量浓度为60 mg/L时，胚性愈伤组织几乎没有增殖。当培养基中卡那霉素质量浓度超过60 mg/L时，胚性愈伤组织颜色由透明变黄色，局部呈现乳白色，部分出现死亡现象，过高质量浓度的卡那霉素对偃松胚性愈伤组织生长具有明显抑制作用，见图7。因此，卡那霉素可作为抗生素进行后续筛选培养，筛选质量浓度为60 mg/L。

2.2.2 遗传转化

选择增殖培养7~10 d的偃松胚性愈伤组织作为试验材料、GV3101农杆菌作为侵染菌体、含有GUS报告基因的pBI121植物表达载体质粒（pBI121-35S：GUS）为转化载体，采用L₄（2²）正交试验对农杆菌介导的偃松胚性愈伤遗传转化侵染条件进行筛选。试验涉及的因素包括菌液菌体密度（optical density，OD）值（0.4和0.5）和侵染时间（15 min和25 min），每个因素设2个水平，按正交试验设计进行试验，重复3次，每次重复设置9块愈伤组织。侵染后放置于常温、黑暗环境下共培养48 h，经脱菌并筛选培养15 d后统计存活率，30 d后统计转化效率。具体操作如下。

1）农杆菌侵染菌液制备。时间在10：00对含有转化载体的农杆菌菌液进行划线培养；2 d后的18：00挑取农杆菌菌落单克隆接种于含有50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素和50 mg/L庆大霉素的20 mL酵母提取物-胰蛋白胨培养基（yeast extract peptone，YEP）液体培养基（5 g/L氯化钠、16 g/L胰蛋白胨和10 g/L酵母提取物），于28 ℃、180 r/min条件下培养约12 h至OD₆₀₀为0.90~1.10；将农杆菌菌液吸取1.5 mL转移至含有50 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素和50 mg/L庆大霉素的50 mL YEP液体培养基再次培养至OD₆₀₀为0.60~0.70；4 ℃、2 200 r/min离心10 min进行菌体收集；将农杆菌菌体用悬浮液（DCR+30 g/L蔗糖+80 μmol/L乙酰丁香酮（AS）+0.1 g/L肌醇+0.5 g/L酸水解酪蛋白+ 500 mg/L谷氨酰胺，pH=5.2）悬浮并稀释至OD₆₀₀为0.4或0.5。

2）侵染及共培养。将增殖培养7~10 d的偃松胚性愈伤组织放进农杆菌悬浮液进行侵染，期间用手轻轻摇动悬浮液，使胚性愈伤组织分散并与菌液密切接触。侵染结束后将悬浮菌液和愈伤组织全部倒出至无菌滤布中，漏掉菌液，用灭菌纸将愈伤组织表面的水分吸干，随后将其接种于表面覆盖一层无菌滤纸的共培养培养基中（含有80 μmol/L AS的最佳愈伤增殖培养基，pH=5.2），置于黑暗条件下共培养48 h。

3）脱菌及筛选培养。共培养结束后用无菌水浸洗愈伤组织2次，每次5 min，再将愈伤组织放入100 mL 500 mg/L头孢霉素溶液中，放在100 r/min的摇床上脱菌30 min。用灭菌滤纸将愈伤组织表面的水分吸干，将其平铺于（覆盖一层无菌滤纸）含卡那霉素的增殖培养基（DCR+0.35 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+60 mg/L卡那霉素，pH=5.8）中，置于（25±1） ℃的黑暗条件下进行培养。大约10 d后能够看到愈伤开始增殖，15 d后愈伤能够充分存活并稳定增殖。

4）转基因愈伤组织的鉴定。为检测上述不同侵染条件的转化效率，本研究分别从基因组水平和蛋白水平对愈伤组织进行鉴定。取遗传转化后的pBI121-35S：GUS抗性愈伤组织，提取基因组DNA。利用抗性愈伤组织的总DNA作为模板，以野生型胚性愈伤组织为阴性对照，pBI121-35S：GUS载体质粒为阳性对照，在分子水平上对筛选出的胚性愈伤组织进行检测。结果表明，在胚性愈伤组织中和质粒中均检测到长度相同的扩增产物，而在野生型胚性愈伤组织中未检测到，见图8（a）。因此，表明含有GUS报告基因的载体成功转入，获得的抗性愈伤组织是转基因愈伤组织。同时，将抗性愈伤组织用GUS组织化学法进行染色处理，以野生型胚性愈伤组织为对照，见图8（b）和图8（c）。经染色后，转化的愈伤组织呈现蓝色，而野生型愈伤组织对照并未显色，见图8（d）。因此，在蛋白水平进一步确定了转化后获得的愈伤组织为转基因愈伤组织，且转基因愈伤成功表达了GUS蛋白。

5）转化效率统计：通过对转化后愈伤组织存活率及转化效率进行统计分析发现，在相同的共培养、脱菌、筛选培养的条件下，不同的侵染条件效果有所差异。在不同的OD₆₀₀和侵染时间的处理组合中，当菌液OD₆₀₀为0.4、侵染时间为15 min时，转化并脱菌15 d后的愈伤存活率最高，且转化效率最大，见表6。

存活率=存活的愈伤组织数量/侵染的愈伤组织总数×100%。（6）

转化效率=获得的转基因愈伤组织数量/存活的愈伤组织数量×100%。（7）

3 讨论与结论

松属植物的体胚发生是实现其高效繁殖与遗传改良的重要技术途径，但不同树种的体胚发生能力存在显著物种特异性。本研究首次建立了偃松的体细胞胚胎发生体系，明确了各阶段的最适培养基配方，其中胚性愈伤诱导的最佳激素配比为DCR+1 mg/L 6-BA+ 2 mg/L NAA，增殖倍数为3.75。在此基础上，成功构建了农杆菌介导的遗传转化体系，在OD₆₀₀为0.4、侵染15 min条件下，转化效率可达68.06%。与已报道的其他松属植物相比，偃松胚性愈伤诱导率（1.11%）低于马尾松的13.3%^［23］和火炬松的63.33%^［17］，这是因为偃松多分布于高纬度寒冷地区，种子自然发育周期长（1~2 a），且存在深度生理休眠特性。取材时若合子胚未达到完全生理成熟或过度成熟，都会导致愈伤组织诱导的“起始活力”不足，最终表现为极低的诱导率。偃松最佳取材时间为每年7月初至7月下旬，已有文章报道球型胚阶段：合子胚处于球状，与完整胚乳共培养可成功诱导稳定增殖胚性愈伤，为适宜诱导发育阶段，同时基因型直接影响胚性愈伤诱导及后续胚性表现。而其胚性愈伤增殖倍数（3.73）则高于油松的2.16^［24］，表明本研究确定的增殖培养基能更好地维持偃松胚性细胞的活性与增殖能力。未来可拓展外植体类型：除合子胚外，探索幼嫩茎尖、针叶等组织作为外植体的诱导潜力，拓宽外植体选择范围；同时测试不同基因型的诱导响应；优化取材精准度，细化7月初至7月下旬的取材时间，建立合子胚生理成熟度指标，避免因合子胚成熟度不足或过度导致的诱导活力缺失。

在体胚发生体系中，胚性愈伤组织的保存也非常重要^［25］。在植物组织培养过程中，继代培养是其中重要的环节，长期继代培养也是种质资源离体保存的必要手段^［26］。已有研究发现，植物细胞在离体培养时，再生效率和再生植株的质量与培养时间、继代频率密切相关^［27］。针叶树胚性组织的生长速度需要频繁的继代培养，通常在每周一次或每两周一次^［28］。随着长期继代培养，胚性愈伤组织的胚性会逐渐下降直至丧失。因此，胚性愈伤组织的合理保存是确保长期利用针叶树胚性培养系统的关键。低温冷冻保存是较为常用存储方式，其允许将植物遗传资源储存在超低温下，并且可以长时间保存而不丧失生存能力^［29］。到目前为止，低温保存已经应用于各种植物，其中就包括针叶树物种。但偃松胚性愈伤组织的最佳冷冻保存方案尚未确定，这部分工作也将是本研究继续探索的一项重点内容。

在遗传转化方面，本研究通过正交试验确定的最优条件（OD₆₀₀为0.4、侵染15 min）下，偃松抗性愈伤阳性率达68.06%，高于日本落叶松的66.2%^［30］，说明该转化体系对偃松具有较好的适用性。但目前仍存在尚未解决的关键问题：转化后的抗性愈伤未能成功诱导体胚。针叶树种的胚性愈伤通常较脆弱，推测可能是遗传转化过程中的农杆菌侵染、抗生素筛选和脱菌等试验步骤对胚性细胞造成损伤^［31］，导致其体胚发生能力丧失。偃松胚性愈伤组织的细胞壁较薄、胞间连接松散，对外部胁迫的耐受度远低于其他种类外植体。而农杆菌菌体密度和侵染时间直接关联“农杆菌毒性胁迫”与“细胞缺氧损伤”，是最易导致胚性丧失或细胞死亡的环节，并且农杆菌菌体密度和侵染时间的物种特异性差异大，对转化效率的影响更显著。因此，农杆菌侵染过程可以作为之后体系优化的核心环节，而共培养时间、抗生素质量浓度等步骤可基于松属已有研究设定基础参数进行尝试。后续研究的3个方向优化：1）调整菌液菌体密度，过高的农杆菌菌体密度会损伤外植体，导致愈伤组织褐变和死亡，相反，农杆菌菌体密度不足则会导致转化率低；2）在共培养阶段添加抗氧化剂（如谷胱甘肽），共培养时间过短会降低外源基因插入受体基因组的概率，时间过长则会使受体材料上的农杆菌过度生长而产生毒害作用，添加抗氧化剂可以减轻农杆菌对胚性细胞的毒性^［32］；3）借助辅助因子促进转化，如BABY BOOM（BBM）、WUSCHEL（WUS）和PETALLOSS（PLT）等辅助基因可促进遗传转化，将其应用于松树的遗传转化能够有效克服基因型的限制^［33］。

本研究建立了偃松从体细胞胚胎发生到农杆菌介导遗传转化的完整技术体系，弥补了偃松在生物技术育种领域的不足，为后续的基因功能研究和遗传改良奠定了坚实的材料基础和技术支撑。研究系统明确了胚性愈伤诱导、增殖、体胚萌发及植株再生的全过程，关键阶段诱导率和增殖倍数显著提升，并成功实现了GUS报告基因的遗传转化。该技术体系为将来偃松基因功能的解析及性状的定向遗传改良提供了可靠的技术平台，所获得的胚性愈伤组织也为偃松的种质资源保存提供了重要的材料基础。

参考文献

[1] LELU-WALTER M A， KLIMASZEWSKA K， CÉLIA M，et al.Somatic embryogenesis for more effective breeding and deployment of improved varieties in Pinus spp.：Bottlenecks and recent advances［J］.Somatic Embryogenesis：Fundamental Aspects and Applications，2016：319-365.

[2] RODRÍGUEZ S M， ORDÁS R J， ALVAREZ J M.Conifer biotechnology：An overview［J］.Forests，2022，13（7）：1061.

[3] FALCON-LANG H J， MAGES V， COLLINSON M.The oldest Pinus and its preservation by fire［J］.Geology，2016，44（4）：303-306.

[4] YANG J， COOPER J D， ZHANG X，et al.Climatic controls of Pinus pumila radial growth along an altitude gradient［J］.New Forests，2021，53（2）：319-335.

[5] 魏晓雪，岳发号，邓睿，等.大兴安岭寒温带针叶林群落特征及其物种多样性［J］.森林工程，2025，41（4）：657-665.

[6] WEI X X， YUE F H， DENG R，et al.Community characteristics and species diversity of coniferous forests in cold temperate zone of Daxing’an Mountains［J］.Forest Engineering，2025，41（4）：657-665.

[7] CHEN F， ZHANG Q， GU H，et al.An approach for extraction of kernel oil from Pinus pumila using homogenate-circulating ultrasound in combination with an aqueous enzymatic process and evaluation of its antioxidant activity［J］.Journal of Chromatography A，2016，1471：68-79.

[8] 赵垦田，李玉昌，张桂玲.大兴安岭偃松林资源及其开发利用与保护［J］.国土与自然资源研究，1997（2）：55-59.

[9] ZHAO K T， LI Y C， ZHANG G L.Exploitation and protection of Pinus pumila forest in Daxingan Mountain［J］.Territory & Natural Resources Study，1997（2）：55-59.

[10] 王思瑶，于宏影，刘亭亭，等.偃松PpDIV1基因克隆及生物信息学分析［J］.温带林业研究，2021，4（3）：38-43.

[11] WANG S Y， YU H Y， LIU T T，et al.Full-length cDNA cloning and bioformatic analysis of PpDIV1 genes from Pinus pumila ［J］.Journal of Temperate Forestry Research，2021，4（3）：38-43.

[12] 刘倩，符潮，胡珊，等.松属植物再生体系和遗传转化的研究现状及展望［J/OL］.分子植物育种，1-10［2025-09-15］.

[13] LIU Q， FU C， HU S，et al.Research status and prospect of regeneration system and genetic transformation in Pinus ［J/OL］.Molecular Plant Breeding，1-10［2025-09-15］.

[14] ZHANG L F， LI W F， XU H Y，et al.Cloning and characterization of four differentially expressed cDNAs encoding NFYA homologs involved in responses to ABA during somatic embryogenesis in Japanese larch （Larix leptolepis）［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，117（2）：293-304.

[15] 袁雪宁，姚凤鸽，安轶，等.CRISPR/Cas基因组编辑在木本植物性状改良中的应用［J］.科学通报，2024（16）：2509-2525.

[16] YUAN X N， YAO F G， AN Y，et al.Application of CRISPR/Cas genome editing in woody plant trait improvement［J］.Chinese Science Bulletin，2024（16）：2509-2525.

[17] YANG X Y， ZHANG X L.Regulation of somatic embryogenesis in higher plants［J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2010，29（1）：36-57.

[18] GAO F， PENG C X， WANG H，et al.Key techniques for somatic embryogenesis and plant regeneration of Pinus koraiensis ［J］.Forests，2020，11（9）：912.

[19] 王璧莹，张秦徽，梁德洋，等.松属树种体胚发生技术研究进展［J］.温带林业研究，2018，1（1）：37-41.

[20] WANG B Y， ZHANG Q H， LIANG D Y，et al.Advances in technology of somatic embryogenesis in Pinus tree species［J］.Journal of Temperate Forestry Research，2018，1（1）：37-41.

[21] WANG Y， YAO R L.Plantlet regeneration of adult Pinus massoniana Lamb.trees using explants collected in March and thidiazuron in culture medium［J］.Journal of Forestry Research，2017，28（6）：1169-1175.

[22] ZHU L H， CHU X F， SUN T Y，et al.Micropropagation of Pinus densiflora and the evaluation of nematode resistance of regenerated microshoots in vitro ［J］.Journal of Forestry Research，2019，30（2）：519-528.

[23] 胡珊，杨春霞，谷振军，等.火炬松体细胞胚胎发生体系的优化［J］.林业科学研究，2022，35（3）：9-17.

[24] HU S， YANG C X， GU Z J，et al.Optimization of somatic embryogenesis for Pinus taeda ［J］.Forest Research，2022，35（3）：9-17.

[25] 滕晓曈，李嘉鑫，李盈，等.油松合子胚愈伤组织诱导和悬浮细胞系的建立［J］.植物学研究，2018，7（2）：209-215.

[26] TENG X T， LI J X， LI Y，et al.Induction of callus from the zygotic embryo of Pinus tabuliformis Carr and establishment of suspension cell line［J］.Botanical Research，2018，7（2）：209-215.

[27] TRET’YAKOVA I N， SHUVAEV D N.Somatic embryogenesis in Pinus pumila and productivity of embryogenic lines during long-term cultivation in vitro ［J］.Russian journal of developmental biology，2015，46（5）：276-285.

[28] HUANG Y， DINER A M， KARNOSKY D F.Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and regeneration of a conifer：Larix decidua ［J］.In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，1991，27：201-207.

[29] 杨加松，秦雅琪，黄桂华，等.松树离体再生和遗传转化体系的研究进展［J］.世界林业研究，2025，38（2）：17-24.

[30] YANG J S， QIN Y Q， HUANG G H，et al.Research progress in in vitro regeneration system and genetic transformation system for Pinus ［J］.World Forestry Research，2025，38（2）：17-24.

[31] 李峰卿，陈金慧，施季森.湿地松×加勒比松杂交种未成熟合子胚诱导体细胞胚胎发生［J/OL］.南京林业大学学报 （自然科学版），1-15［2025-10-16］.

[32] LI F Q， CHEN J H， SHI J S.Induction of somatic embryogenesis from immature zygotic embryos of Pinus elliottii × Pinus caribaea hybrid［J/OL］.Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），1-15［2025-10-16］.

[33] 于晓芳.马尾松胚性愈伤组织诱导与增殖研究［D］.长沙：中南林业科技大学，2012.

[34] YU X F.Induction and proliferation of embryogenic callus in Pinus massoniana ［D］.Changsha：Central South University of Forestry and Technology，2012.

[35] 李亦轩.油松体胚发生优化与遗传转化的初步研究［D］.北京：北京林业大学，2019.

[36] LI Y X.Preliminary study on optimization of somatic embryogenensis and preliminary study on genetransfer of Chinese Pine （Pinus tabulaeformis C.）［D］.Beijing：Beijing Forestry University，2019.

[37] 柯欣，费琪，夏馨蕊，等.抗松针褐斑病湿地松胚性愈伤组织诱导及体胚产量影响因素的研究［J］.南京林业大学学报 （自然科学版），2025，49（1）：87-94.

[38] KE X， FEI Q， XIA X R，et al.The factors influencing the embryogenic callus initiation and somatic embryo yield in Pinus elliottii resistant to pine needle brown spot disease［J］.Journal of Nanjing Forestry University （Natural Sciences Edition），2025，49（1）：87-94.

[39] 刘玲梅，汤浩茹，刘娟.试管苗长期继代培养中的形态发生能力与遗传稳定性［J］.生物技术通报，2008（5）：22-27.

[40] LIU L M， TANG H R， LIU J.Morphogenetic capacity and genetic stability of tissue in vitro cultures in long-term subculturing［J］.Biotechnology Bulletin，2008（5）：22-27.

[41] 薛美凤，郭余龙，李名扬，等.长期继代对棉花胚性愈伤组织体胚发生能力及再生植株变异的影响［J］.西南农业学报，2002（4）：19-21.

[42] XUE M F， GUO Y L， LI M Y，et al.Effects of long-term subculture on embryogenesis capability of cotton callus and somatic variation［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2002（4）：19-21.

[43] KLIMASZEWSKA K， WARD C， CHELIAK W M.Cryopreservation and plant regeneration from embryogenic cultures of Larch （Larix×eurolepis） and black spruce （Picea mariana）［J］.Journal of Experimental Botany，1992，43（1）：73-79.

[44] CARNEROS E， HERNÁNDEZ I， TORIBIO M，et al.Effect of different cryoprotectant procedures on the recovery and maturation ability of cryopreserved Pinus pinea embryogenic lines of different ages［J］.In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2017，53：469-477.

[45] 张艾婧，蒋湘宁，盖颖.日本落叶松胚性愈伤组织遗传转化方法的优化［J/OL］.分子植物育种，1-13［2025-11-07］.

[46] ZHANG A J， JIANG X N， GAI Y.Optimization of genetic transformation method for embryogenic callus of Larix kaempferi ［J/OL］.Molecular Plant Breeding，1-13［2025-11-07］.

[47] 刘炎，刘克俭，王江，等.农杆菌介导的针叶树种遗传转化研究进展［J］.黑龙江农业科学，2021（4）：136-141.

[48] LIU Y， LIU K J， WANG J，et al.Research progress on agrobacterium mediated genetic transformation of conifer species［J］.Heilongjiang Agricultural Sciences，2021（4）：136-141.

[49] 刘大丽，马龙彪.谷胱甘肽合成酶StGCS-GS对甜菜遗传转化的研究［J］.中国糖料，2018，40（5）：18-21.

[50] LIU D L， MA L B.Genetic ttransformation of Beta vulgaris with gutathione synthetase StGCS-GS［J］.Sugar Crops of China，2018，40（5）：18-21.

[51] WANG K， SHI L， LIANG X N，et al.The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation［J］.Nature Plants，2022，8（2）：110-117.

基金资助

农业生物育种国家科技重大专项(2023ZD0405904)