雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞自噬的影响

摘要

目的：探讨雷帕霉素对光诱导下视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）自噬的影响。方法：将自噬双标mRFP-eGFP-LC3质粒转染进ARPE-19细胞中获得稳定表达的转染细胞株，随后随机分为6 h对照组、6h模型组、6 h雷帕霉素组；12 h对照组、12 h模型组、12 h雷帕霉素组和24 h对照组、24 h模型组、24 h雷帕霉素组。对照组避光培养，模型组受光照刺激；雷帕霉素组加入10μmol/L雷帕霉素后受光照刺激，光源采用LED冷光灯，在（16 500±500） lx光照强度下照射细胞6、12、24 h。检测转染效率，MTT检测ARPE-19细胞存活率；激光共聚焦显微镜对自噬流变化进行定性分析，透射电镜观察细胞自噬形态；蛋白免疫印迹法对Beclin1、LC3、P62自噬相关蛋白表达量进行检测。结果：与对照组相比，模型组光照6、12、24 h后，细胞存活率显著下降（P<0.001）；雷帕霉素组经光照后细胞存活率高于模型组（P<0.05）。光照6、12、24 h后模型组红色荧光斑点较对照组逐渐增多，绿色荧光斑点也随之增加，Merge图中从光照12 h开始黄色斑点数量增多明显。雷帕霉素组在光照6、12、24 h时红色荧光斑点较模型组加强，绿色荧光较模型组弱。透射电镜观察发现模型组胞内见较多的自噬泡，雷帕霉素组细胞见大量聚集分布自噬囊泡。蛋白免疫印迹结果发现光照6、12、24 h后，模型组中自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的相对表达水平均增加，P62蛋白表达较低。而采用雷帕霉素干预后，与模型组相比，雷帕霉素组在光照6 h时Beclin 1蛋白表达量差异不明显、在12、24h时Beclin 1蛋白表达量逐渐升高；LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值均高于模型组；P62蛋白表达量差异不显著。结论：光照可诱导ARPE-19细胞自噬现象的发生，且雷帕霉素能上调其自噬活性。

关键词

年龄相关性黄斑变性 / 视网膜色素上皮细胞 / 光损伤 / 雷帕霉素 / 自噬