健脾清化方改善局灶节段性肾小球硬化的效应机制研究

摘要

目的：探讨健脾清化方对局灶节段性肾小球硬化（FSGS）小鼠及阿霉素诱导足细胞损伤的保护作用，并观察其对炎症反应、氧化应激及细胞凋亡的影响。方法：（1）体内实验：实验组balb/c小鼠，采用单次尾静脉注射阿霉素（10.5 mg/kg）的方法建立FSGS动物模型，造模后连续灌胃给药6周。测定24 h尿蛋白（定量）、血肌酐，及肾组织内超氧化物歧酶、丙二醛、过氧化氢酶的水平。并采用H&E、Masson、PAS染色，观察肾组织病理损伤程度。透射电镜观察肾脏超微结构。免疫荧光nephrine/p-JAK2双染观察足细胞上p-JAK2的表达。免疫印迹法检测（westernblotting,WB）肾组织中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达水平。（2）体外实验：实验1：采用CCK-8法检测阿霉素及健脾清化方对细胞活力的影响，并筛选出造模和健脾清化方干预浓度。DCFH-DA荧光探针检测各组足细胞ROS的含量。流式细胞术测定足细胞凋亡情况。WB检测p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1的蛋白表达水平以及RT-qPCR检测STAT3下游凋亡因子BAX、BAD、Caspase3、p21、Blc-2、和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达情况。实验2:WB检测JAK2激动剂C-A1对p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3蛋白表达的影响。结果：（1）体内实验：与对照组相比，模型组小鼠肾小球硬化，足细胞足突广泛融合，肾组织p-JAK2荧光表达明显增加。24h尿蛋白定量、血肌酐、MDA升高，SOD、CAT降低（P<0.05）。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达升高。与模型组相比健脾清化方干预后足细胞损伤缓解，肾组织P-JAK2荧光表达降低，24 h尿蛋白定量、血肌酐、MDA降低，SOD、CAT升高。p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1表达降低（P<0.05）。（2）体外实验：实验1:CCK-8法确定阿霉素造模浓度为0.4μg/mL，健脾清化方干预低中高浓度分别为1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL。与对照组比较，模型组凋亡细胞数量、ROS含量增多，p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、TGF-β1蛋白表达升高（P<0.05）,BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达降低，Blc-2 mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，健脾清化方干预后，凋亡细胞数量、ROS含量减少，JAK2/STAT3、TGF-β1蛋白表达降低，BAX、BAD、Caspase3、p21、IL-6、TNF-α、IL-1β的mRNA表达升高，Blc-2的mRNA表达降低，且成量效关系（P<0.05）。实验2：与对照组相比，C-A1组p-JAK2/JAK2蛋白表达升高（P<0.05）；与ADR+H组相比，ADR+H+C-A1组p-STAT3/STAT3蛋白表达升高（P<0.05）。结论：健脾清化方可通过抑制JAK2/STAT3信号通路，调节炎症反应、细胞凋亡、氧化应激从而延缓FSGS足细胞损伤的进展。

关键词

局灶节段性肾小球硬化 / 足细胞损伤 / 健脾清化方 / JAK2/STAT3