“玛瑙红”樱桃花变绿植原体鉴定及快速检测体系构建

摘要

为确定导致贵州“玛瑙红”樱桃花变绿的植原体种类并构建快速的检测方法，通过使用tuf基因通用引物进行PCR扩增，并对扩增片段进行测序、Blast比对和同源性分析，进而构建系统进化树，确定了引起花变绿的植原体的分类地位。基于获得的tuf基因序列，设计了一对特异性引物，并对dNTPs、MgSO₄、Bst2.0 DNA聚合酶浓度、引物比例以及反应程序进行了优化，构建环介导等温扩增（LAMP）反应体系，同时结合滤纸条DNA快速提取方法，建立了一种不依赖PCR仪、高灵敏度、简便快捷且可视化的检测技术。结果表明，“玛瑙红”樱桃花变绿植原体被鉴定为属于16SrV-B亚组；优化的LAMP体系为DNTPs最终浓度1.4 mmol/L,MgSO₄最终浓度10.0 mmol/L,内外引物浓度比1∶10（外侧引物浓度固定为0.2μmol/L）,Bst2.0 DNA聚合酶最终浓度0.32 U/μL,DNA模板量31.7 ng/μL,1×Isothermal Amplification Buffer（等温扩增缓冲液）,在60℃下恒温反应50 min,对“玛瑙红”樱桃花变绿植原体检测灵敏度达到3.96×10^-4 ng/μL,是传统PCR的100倍，且通过反应液颜色变化实现了检测结果的可视化。研究不仅明确了贵州“玛瑙红”樱桃花变绿植原体的分类地位，还建立了一种无需依赖高端设备的快速检测技术，为樱桃植原体疾病的快速诊断提供了新方法，有助于田间病害的早期监测与控制。

关键词

植原体 / 序列比对 / LAMP可视化 / 纤维素滤纸条法 / 樱桃 / 花变绿