肠膜明串珠菌‘WZ-44’的筛选鉴定、生防特性及其对梨火疫病防效

Screening, identification, biocontrol characteristics of Leuconostoc mesenteroides ‘WZ-44’ and its efficacy against pear fire blight

摘要

为获得对梨火疫病菌（Erwinia amylovora）拮抗活性强的生防细菌，分析其生防特性，评价其对梨火疫病生防效果，从新疆库尔勒市梨火疫病发生果园采集香梨花、幼果和嫩梢等组织，分离纯化不同形态的细菌，采用平皿对峙法筛选具有较强拮抗活性的菌株，基于菌落菌体形态、生理生化特征和16S rDNA序列明确其分类地位，测定其适宜培养温度、产酸能力和次生抗菌物质稳定性，比较生防菌次生代谢物和3种防治梨火疫病杀菌剂的抑菌活性，利用透射电镜分析次生代谢物处理后的梨火疫病菌形态和结构的变化，并通过平皿抑菌试验和温室生防试验评价生防菌株的防效。结果表明：1）从香梨幼果表面分离鉴定到1株肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）‘WZ-44’，其对梨火疫病菌、亚洲梨火疫病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、大白菜软腐病菌均具有较强拮抗活性，拮抗圈直径（d）为17.7~24.7 mm；2）‘WZ-44’适宜生长温度范围广（15~35 ℃），产酸能力强，其次生代谢物对梨火疫病菌也具有较强抗菌活性，拮抗圈d为（26.0±0.4） mm，其抗菌活性与40 μg/mL春雷霉素盐酸盐相当，拮抗圈d为（25.4±0.5） mm，且显著优于100 μg/mL噻霉酮（拮抗圈d 为13.9±0.9 mm）和500 μg/mL噻唑锌（拮抗圈d为7.4±0.8 mm）（P<0.05）；3）‘WZ-44’次生代谢物抗菌活性在pH 3.0最强，且对高温、蛋白酶和紫外照射具有较好耐受性，通过破坏病原菌细胞膜完整性，导致细胞内容物外渗，细胞变形，甚至崩溃死亡；4）‘WZ-44’与杀菌剂春雷霉素盐酸盐兼容性好，制备的生防菌剂对花期梨火疫病预防效果达（76.1±9.6）%。综上，肠膜明串珠菌‘WZ-44’对梨火疫病菌拮抗活性强，次生抗菌物质稳定，易于发酵培养，生防效果好，可作为一种防控梨火疫病的新型生防细菌。

Abstract

In order to obtain biocontrol bacteria with strong antagonistic activity against Erwinia amylovora， analyze its biocontrol characteristics and evaluate its biocontrol effect on pear fire blight， different forms of bacteria were isolated and purified from pear flowers， young fruits， and tender shoots collected from the orchards with pear fire blight in Korla City， Xinjiang. The plate confrontation method was used to screen strains with strong antagonistic activity against E. amylovora. Based on the morphology， physiological and biochemical characteristics， and 16S rDNA sequence， its classification status was clarified. The suitable temperature for bacteria cultivation， acid production ability， and stability of secondary antibacterial substances were determined. The antibacterial activity of its secondary metabolites was compared with three bactericides for E. amylovora. The morphological and structural changes in E. amylovora cells treated with secondary metabolites of the strain identified was analyzed using transmission electron microscopy. Furthermore， the plate antibacterial test and greenhouse biocontrol test were used to evaluate the efficacy of the biocontrol strain. The results showed that： 1） Leuconostoc mesenteroides ‘WZ-44’ was isolated and identified from the surface of young pear fruits， which displayed strong antagonistic activities against E. amylovora， E. pyrifoliae， Pseudomonas syringae pv. lachrymans， and Pectobacterium carotovorum， and the antagonistic circle diameter （d） was within range 17.7-24.7 mm； 2） The ‘WZ-44’ strain has a wide suitable growth temperature range （15-35 ℃） and strong acid production ability. Its secondary metabolites also has strong antibacterial activity against E. amylovora （its antagonistic circle diameter （d） is 26.0±0.4 mm）， which is equivalent to 40 μg/mL kasugamycin hydrochloride （25.4±0.5 mm） and significantly （P<0.05） better than 100 μg/mL benziothiazolinonc （13.9±0.9 mm） and 500 μg/mL zine thiazole （7.4±0.8 mm）； 3） The antibacterial activity ‘WZ-44’ secondary metabolites is the strongest at pH 3.0， and it has good tolerance to high temperature， protease， and ultraviolet irradiation. It could destroy the integrity of pathogenic bacterial cell membranes， leading to extravasation of cell contents， cell deformation， and even collapse and death； 4） The‘WZ-44’ strain has good compatibility with kasugamycin hydrochloride. The ‘WZ-44 ’biocontrol agent has a （76.1±9.6）% preventive effect for pear fire blight during the flowering period. In summary， ‘WZ-44’ has strong antagonistic activity against E. amylovora and stable secondary antibacterial substances. It is easy to be fermented and cultivated， and has good biocontrol effect. It can be used as a new type of biocontrol bacterium to prevent and control pear fire blight.

Graphical abstract

关键词

梨火疫病 / 肠膜明串珠菌 / 生物防治 / 次生代谢物

Key words

pear fire blight / Leuconostoc mesenteroides / biological control / secondary metabolites

梨火疫病包括梨火疫病和亚洲梨火疫病，分别由梨火疫病菌（Erwinia amylovora）和亚洲梨火疫病菌（E. pyrifoliae）引起，是梨、苹果等蔷薇科果树上的检疫性细菌病害^［1］。该病害主要为害梨的花、果实、叶片和嫩梢，破坏性很强，不仅能够大幅降低果实产量和品质，而且还会造成死树，甚至毁园，目前已扩展到60多个国家和地区^［2］。梨火疫病在新疆梨和苹果产区、甘肃河西走廊个别梨园均有发生，并存在向我国梨和苹果其他产区扩散的风险；亚洲梨火疫病在浙江西北部、重庆个别果园均已有零星发生^［3-4］。目前，梨火疫病的控制主要依靠化学药剂防治，如噻唑锌、噻霉酮、氢氧化铜、春雷霉素等^［5］。然而，这些农药长期大量使用会导致病原菌抗药性增强，用药成本高，花期施药易产生药害，且对果品安全和果园生态环境构成严重威胁。近年来，具有安全、无残留、环境友好等优点的微生物源农药产业发展迅速，已成为国际绿色农药发展重点^［6］。因此，从梨园生境筛选生防菌株，研发高效生物农药，对梨火疫病防控和梨果安全生产具有重要意义。

目前，国外已有以出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）和噬菌体为活性成分的2个登记产品（Blossom Protect和Agriphage™-Fire Blight），对梨火疫病的防效均达60%以上^［7-8］。在国内，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）‘Xl 96-3’已获登记为防控梨火疫病（农药登记证号 PD20240500）的生防菌；白雪莹等^［9］发现2株橙色粘球菌（Myxococcusfulvus）对梨火疫病菌具有较强捕食能力，温室盆栽试验结果显示，对梨火疫病保护性防效均可达75%以上；马云涛等^［10］发现贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）‘JK2’菌株对梨火疫病菌具有较强拮抗活性，利用野苹果（Malus sieversii）果实进行室内防效试验，对梨火疫病的保护性防效达65%。但是，目前可供果农选择的梨火疫病生防菌剂类型仍然有待丰富。

肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是乳酸菌中明串珠菌属的重要菌种，革兰氏阳性，广泛存在于植物体表^［11］。一些肠膜明串珠菌表现较好的抗菌活性，可产生多肽、细菌素、有机酸等抗菌活性物质，在植物病害防控上表现出巨大的潜力^［12］。王嘉悦等^［13］揭示了肠膜明串珠菌‘WJY-6’菌株产生的细菌素对多株金黄色葡萄球菌耐药菌株表现较强的抑菌活性；Chakchouk-Mtibaa等^［14］从发酵橄榄中分离1株肠膜明串珠菌‘YB1’，其对橄榄黄萎病菌（Verticillium dahliae）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）均表现出较强拮抗活性，主要抗菌物质为一种活性肽“细菌素”。但是，利用肠膜明串珠菌防治梨火疫病方面的研究鲜见报道。本研究利用平皿对峙法从库尔勒香梨幼果表面分离筛选到1株对梨火疫病菌具有较强拮抗活性的细菌‘WZ-44’，根据生理生化特性和16S rDNA核苷酸序列，确定该菌株的分类地位，测定其生物学和抗菌特性，分析其抑菌机制，初步评估其生防效果，旨在筛选对梨火疫病菌（E. amylovora）具有较强拮抗活性的生防细菌，以期为开发防治梨火疫病的微生物农药提供参考。

1　材料与方法

1.1　试验材料及培养基

供试菌株共9个，均来自本实验室保存，见表1。本研究应用的培养基包括NB培养基、MRS培养基、PDA培养基，固体培养基另加15 g/L的琼脂粉，121 ℃灭菌20 min。

1.2　试验方法

1.2.1　梨生态位细菌的分离纯化和生防菌株的筛选

从新疆维吾尔自治区库尔勒市香梨园（41.6144° N，86.0097° E，海拔906 m）采集花、幼果和嫩梢等44份，将样品剪碎混匀，取10 g放入盛有50 mL ddH₂O的250 mL三角瓶中，28 ℃条件下震荡培养30 min；静置取上清，梯度稀释涂布于NB固体培养基上，28 ℃条件下培养36 h。挑取色泽、形态差异的单菌落，在NA平板上划线纯化2次，对纯化菌株进行编号，4 ℃保存备用^［15］。

以梨火疫病菌为靶标，采用平皿拮抗法对分离的菌株进行筛选^［16］。首先将保存于NA平板上的各菌株在NB液体培养基中培养，在150 r/min、28 ℃条件下培养24 h，作为种子液备用；另外，挑取梨火疫病菌‘KL20-28’单菌落接种到NB液体培养基，150 r/min、28 ℃条件下培养12~16 h，将培养液调整到OD₆₀₀≈1.0，按照1%（V/V）的比例添加到液态的低温NB固体培养基中，迅速混匀，制备含菌的NB固体培养基；将待测菌株种子液2 µL点到制备的NB固体培养基中央；然后28 ℃培养36 h，通过拮抗圈的直径（d）评估待测菌株对梨火疫病菌的拮抗活性。

1.2.2　拮抗菌株的抗菌谱测定

选取拮抗圈d>15 mm的菌株，按照上述方法测定初选拮抗菌株对亚洲梨火疫病菌‘WZ20-3’、梨锈水病菌‘B19’、黄瓜细菌性角斑病菌‘PSL’、大白菜软腐病菌‘PCC’等细菌的拮抗活性。拮抗菌株对真菌拮抗活性的测定参考杨晓蕾等^［17］的方法，分别在PDA平板中央接种梨树腐烂病菌‘VP94’、梨黑斑病菌‘HB55’、梨炭疽病菌‘NC40’、梨轮纹病菌菌饼（d=5 mm），分别对称接种3处生防菌菌悬液和1处无菌水各2 µL，28 ℃培养4 d，观察待测菌株对4种梨树病原真菌的拮抗活性。

采用琼脂扩散法测定拮抗菌株次生代谢物的抗菌谱^［16］。将‘WZ-44’原液（OD₆₀₀≈1.0）以1%（V/V）的比例接种到50 mL MRS培养基中，28 ℃静置培养24 h后，4 ℃，6 000 r/min离心10 min，取上清，用0.22 µm微孔滤膜过滤除菌后，制备‘WZ-44’发酵无菌滤液。参照上述1.2.1方法制备含菌NB固体培养基，之后用灭菌打孔器（d = 5 mm）打孔，每孔加入30 µL生防菌株‘WZ-44’无菌发酵滤液，28 ℃培养36 h，测量抑菌圈直径（d）。每个处理3组重复。

1.2.3　生防菌株‘WZ-44’的鉴定

挑取‘WZ-44’单菌落，在MRS固体平板上划线培养，28 ℃培养36 h，观察记录菌落形态。参照苗成琪等^［16］的方法，制备收集‘WZ-44’菌体，然后用2.5%的戊二醛固定12 h以上，送江苏省农业科学院中心实验室扫描电镜室观察菌体形态。

委托中国农业微生物菌种保藏管理中心，使用BIOLOG GENIII 试剂盒（BIOLOG，美国）对菌株‘WZ-44’生理生化特征进行测定。

利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取‘WZ-44’的总基因组DNA。利用细菌16S rDNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）PCR扩增DNA片段^［16］。PCR产物送北京擎科生物科技股份有限公司测序，将测序结果与NCBI数据库比对分析。应用MEGA 7.0生物软件，采用Neighbor-Joining法构建系统发育树^［18］。

1.2.4　‘WZ-44’生物学特性测定

取‘WZ-44’的种子液（OD₆₀₀≈1.0），按2%（V/V）的比例接种到含有50 mL MRS液体培养基的250 mL锥形瓶中，用于测定‘WZ-44’适宜生长温度和产酸能力。将发酵菌液分别置于10、15、20、25、30、35、40 ℃条件下培养，并分别于接种后0、4、8、12、24、36、48、60 h测定发酵液的光密度值（OD₆₀₀）。每个处理重复3次。另取‘WZ-44’发酵菌液在28 ℃下静置培养，分别于接种后0、4、8、12、24、36、48、60 h取样，用梅特勒-托利多FE-20 pH计（METTLER-TOLEDO， 瑞士）测定发酵液的pH，以评价‘WZ-44’的产酸能力^［19］。每个样品设置3个重复。

1.2.5　‘WZ-44’次生抗菌活性物质特性分析

取‘WZ-44’的种子液，按2%（V/V）接种至装有50 mLMRS培养基的三角瓶中，28 ℃条件下静置培养，分别于接种后24、36和48 h取样，将发酵液6 000 r/min离心10 min，取上清，利用0.22 µm细菌过滤器过滤除菌，得到无菌发酵滤液，保存于-70 ℃备用。采用琼脂扩散法^［16］测定‘WZ-44’不同发酵时间无菌滤液对梨火疫病菌的拮抗活性，以无菌MRS液体培养基为对照。

分别将春雷霉素盐酸盐和噻霉酮溶于ddH₂O，配置40 μg/mL春雷霉素盐酸盐和100 μg/mL噻霉酮溶液；利用DMSO配置500 μg/mL噻唑锌溶液。采用平板对峙法^［16］测定‘WZ-44’发酵36 h的无菌滤液（T₁）、噻霉酮（T₂）、噻唑锌（T₃）、春雷霉素盐酸盐（T₄）对梨火疫病菌的抑菌活性。每组处理重复3次。

1.2.6　‘WZ-44’次生抗菌活性物质稳定性分析

取分装的‘WZ-44’发酵36 h的无菌滤液，分别于60 ℃水浴30 min、80 ℃水浴30 min、100 ℃水浴5 min，以室温（25 ℃）条件下放置的发酵无菌滤液为对照，然后以梨火疫病菌‘KL20-28’作为靶标菌，分别对其抑菌活性的热稳定性进行检测。试验设置3个重复。

取分装的无菌滤液，分别利用终浓度为100 μg/mL的蛋白酶K（P₁）、胃蛋白酶（P₂）、胰蛋白酶（P₃），37 ℃水浴处理3 h，以未处理的‘WZ-44’发酵无菌滤液为对照（CK）；然后以梨火疫病菌‘KL20-28’作为靶标菌，分别对其抑菌活性进行蛋白酶稳定性检测。试验设置3个重复。

取5 mL无菌滤液，放入无菌培养皿，打开皿盖，置于超净工作台25 W紫外灯下60 cm处，垂直向下照射处理1 h，以超净工作台内日光灯（可见光）照射处理的发酵无菌滤液为对照；1 h后，分别用0.22 μm细菌过滤器对紫外和可见光照射处理的滤液进行再次过滤，然后以梨火疫病菌‘KL20-28’作为靶标菌，分别对其抑菌活性进行紫外稳定性检测。试验设置3个重复。

pH稳定性：将5 mL发酵无菌滤液于10 mL离心管，分别用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）调pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，室温放置1 h，然后用0.22 µm细菌过滤器过滤，以未处理的发酵无菌滤液为对照（CK），未处理发酵无菌滤液pH约4.1；将5 mL发酵无菌滤液置于10 mL离心管，分别调pH至3.0、7.0、9.0，室温放置1 h，然后取pH 7.0、9.0的无菌滤液2.5 mL，利用稀盐酸调整pH至4.0，将各处理无菌滤液用0.22 µm细菌过滤器过滤。将梨火疫病菌‘KL20-28’原液（OD₆₀₀≈1.0）按照1%（V/V）的比例添加到液态的低温NA培养基中，迅速混匀，制备含菌NB固体培养基；待平板凝固后，利用灭菌打孔器在平板中心及距离中心25 mm处均匀打孔，孔径5 mm，每孔添加上述不同处理的发酵无菌滤液30 µL，28 ℃条件下培养36 h，测定拮抗圈直径。每个处理3个重复。

1.2.7　‘WZ-44’次生抗菌物质对梨火疫病菌形态和结构的影响

吸取5 mL‘WZ-44’发酵36 h的无菌上清液，分别悬浮处理梨火疫病菌菌体5、15、60 min后，离心弃上清（4 000 r/min、4 ℃、10 min），得到处理后的梨火疫病菌菌体，以未处理的梨火疫病菌菌体为对照（0 min）。将梨火疫病菌菌体用磷酸盐缓冲液PBS清洗2~3次，然后用2.5%（V/V）的戊二醛固定，送南京农业大学进行透射电子电镜（transmission electronic microscopy，TEM）观察^［20-21］。

1.2.8　‘WZ-44’对2种防治梨火疫病杀菌剂的耐受性测定

分别将春雷霉素盐酸盐和中生菌素溶于无菌水，配制10 mg/mL春雷霉素盐酸盐和10 mg/mL中生菌素母液；再分别制备春雷霉素盐酸盐终浓度为10、20、40和80 μg/mL的NB固体培养基，中生菌素终浓度为5、10、20和40 μg/mL的NB固体培养基。将生防菌株‘WZ-44’发酵液（OD₆₀₀≈1.0）和梨火疫病菌‘KL20-28’菌株发酵液（OD₆₀₀≈1.0）分别稀释5×、25×、125×，分别吸取2 μL‘WZ-44’和‘KL20-28’发酵液原液（1×）及各浓度稀释液滴加在含上述杀菌剂的NA平板上，28 ℃培养2 d，观察菌落的生长情况。每个处理重复3次。

1.2.9　‘WZ-44’菌剂对花期梨火疫病的预防效果

按上述1.2.1描述方法制备‘WZ-44’种子液，将‘WZ-44’种子液按2%（V/V）的比例接种到含200 mL MRS液体培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃条件下培养36 h，菌液浓度约1.5×10⁹ CFU/mL；向上述制备得到的‘WZ-44’发酵液中添加0.1%（V/V）吐温80和0.15%（m/V）预处理好的黄原胶，充分搅拌混匀，即为‘WZ-44’生防菌剂，备用。同时，挑取梨火疫病菌‘KL20-28’单菌落接种到含25 mL NB液体培养基的100 mL锥形瓶中，150 r/min、28 ℃条件下培养 24 h，10 000 r/min、4 ℃条件下离心5 min 收集菌体，然后利用无菌水将菌体密度调整到1.0×10⁸ CFU/mL左右，再添加0.1%（V/V）吐温80，即为病菌接种液。

采集一年生初花期的梨枝条，开展肠膜明串珠菌‘WZ-44’菌剂对花期梨火疫病的预防试验，试验设置先喷施生防菌剂3×稀释液（菌液浓度约5.0×10⁸ CFU/mL），24 h后再喷施梨火疫病菌接种液的预防处理（YF）；仅喷施梨火疫病菌接种液的接种病菌处理（JZ）；仅喷施生防菌剂3×稀释液作为空白对照（CK₁），3个处理均设3个重复组，每个重复用2个枝条。所有处理放置在24~28 ℃温室内，相对湿度85%左右，光周期12 h/12 h。接种病原菌4 d后参照文献［10］和［15］的方法，调查各处理发病花朵、发病叶片及叶片病害级数，统计病花率、病叶率、病情指数和‘WZ-44’生防菌剂的防效。

叶片受害分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；

3级：病斑面积占整个叶面积的≥5%~10%；

5级：病斑面积占整个叶面积的>10%~20%；

7级：病斑面积占整个叶面积的>20%~50%；

9级：病斑面积占整个叶面积的>50%以上。

病情指数=［∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查叶片总数×9）］×100

防治效果=（对照处理病情指数-预防处理病情指数）/对照处理病情指数×100%

1.2.10　数据分析

采用Microsoft Excel 2016软件统计和分析数据，应用DPS V20.05软件对试验数据进行单因素方差分析，使用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2　结果与分析

2.1　生防菌株的分离筛选及抗菌谱测定

由图1可知，平板对峙筛选试验表明，‘WZ-44’菌株对梨火疫病菌拮抗活性最强，抑菌圈d为17.7±0.6 mm。同时发现该菌株对亚洲梨火疫病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、大白菜软腐病菌等都有较强的抑制作用，拮抗圈d分别为24.7±0.6、18.0±0.0、17.7±0.6 mm，对梨锈水病菌、梨树腐烂病菌、梨黑斑病菌、梨炭疽病菌也具有一定的拮抗活性。

由图2可知，‘WZ-44’在MRS培养基中发酵24 h的无菌上清液对梨火疫病菌、亚洲梨火疫病菌、梨锈水病菌、大白菜软腐病菌均具有较强拮抗活性，拮抗圈直径（d）分别为24.3±0.6、22.7±0.6、23.3±0.6、24.7±0.6 mm，对黄瓜细菌性角斑病菌也具有一定拮抗活性。

2.2　生防菌株‘WZ-44’的鉴定

2.2.1　形态学特征

菌株‘WZ-44’在MRS固体培养基平板上生长，单菌落为乳白色，表面光滑，圆形或豆形，直径0.8~1.2 mm；利用扫描电镜进行观察，其菌体形态为球形，直径0.5~0.7 µm（图3）。

2.2.2　生理生化特征

生防菌株‘WZ-44’的BIOLOG GENIII试剂盒理化试验分析结果表明，革兰氏阳性，接触酶和氧化酶阴性；在试验范围内，可利用麦芽糖、D-葡萄糖、D-果糖、蔗糖等16种糖类，但不能利用乳糖、菊糖、L-鼠李糖、淀粉等12种糖类（表2）。

2.2.3　分子生物学鉴定

菌株‘WZ-44’的16S rDNA序列片段长度为1 372 bp （NCBI检索号：PV276448）。基于获得的16S rDNA基因序列和GenBank数据库，利用MEGA 7.0软件对‘WZ-44’进行进化树分析，该菌株与肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）聚合在一起（图4）。综合‘WZ-44’的菌落菌体形态、生理生化测定及系统发育分析的结果，将菌株‘WZ-44’鉴定为肠膜明串珠菌（L. mesenteroides）。

2.3　生防菌株‘WZ-44’生物学特性

2.3.1　不同温度下‘WZ-44’的生长动态

由图5可知，‘WZ-44’在不同温度的生长动态差异明显，但其生长趋势随温度的变化基本一致；‘WZ-44’的最适生长温度为25~35 ℃，接种后12 h的OD₆₀₀达到2.178~2.409；在15~20 ℃，也能达到较高生长量。

2.3.2　生防菌株‘WZ-44’产酸能力测定

由图6可知，随着‘WZ-44’发酵进程的推进，MRS培养液的pH快速下降，在培养24 h后pH从初

始的6.19降至4.30，此后达到稳定。这表明，‘WZ-44’在增殖过程中会快速产生大量的酸性代谢物。

2.4　‘WZ-44’抗菌活性物质特性及其稳定性分析

2.4.1　发酵时间对‘WZ-44’发酵无菌滤液抗菌活性的影响

由图7可知，‘WZ-44’发酵24、36和48 h的无菌滤液对梨火疫病菌均具有较强的拮抗活性，拮抗圈d分别为19.3±0.6、26.7±0.6和17.7±0.6 mm。这表明，‘WZ-44’在MRS培养基中发酵36 h的无菌滤液抗菌活性最强。

2.4.2　‘WZ-44’抗菌活性物质与3种杀菌剂的抑菌活性比较

由图8可知，‘WZ-44’发酵36 h的无菌滤液与40 μg/mL春雷霉素盐酸盐的拮抗圈d分别为26.0±0.4和25.4±0.5 mm，均显著大于100 μg/mL噻霉酮（d=13.9±0.9 mm）和500 μg/mL噻唑锌（d=7.4±0.8 mm）的拮抗圈d（P<0.05）。这表明，‘WZ-44’发酵36 h的无菌滤液抗菌活性与40 μg/mL春雷霉素盐酸盐相当。

2.4.3　‘WZ-44’抗菌活性物质的稳定性分析

由图9可知，蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理对‘WZ-44’的发酵无菌滤液的抑菌活性无显著影响；25、60、80、100 ℃处理对‘WZ-44’的发酵无菌滤液的抗菌活性无显著影响；紫外照射处理对‘WZ-44’次生抗菌物质的抗菌活性无显著影响（图9（c））。‘WZ-44’发酵无菌滤液的抗菌活性在pH≤5.0表现出较好的稳定性，但是pH>5.0时开始下降，pH≥6.0环境下抗菌活性完全丧失（图9（d））；但是将失去抗菌活性的发酵无菌滤液的pH调回4.0时，其抗菌活性几乎完全恢复。上述结果表明，‘WZ-44’次生抗菌物质具有较好的热稳定性、蛋白酶和紫外照射处理耐受性，能够抵御大田环境中的紫外光照射，表现出较好的酸稳定性和可逆性。

2.5　‘WZ-44’次生代谢物对梨火疫病菌形态及结构的影响

由图10可知，未经‘WZ-44’发酵无菌滤液处理0 min的梨火疫病菌呈典型的棒状结构，表面平坦完整，膜边界清晰，细胞内原生质体填充密集，高密度，胞质区域均匀。而用‘WZ-44’的发酵无菌滤液处理后的梨火疫病菌显示出明显的变异性：‘WZ-44’发酵无菌滤液处理5 min时，细胞膜开始出现皱缩，出现质壁分离现象；处理15 min时，细菌的胞质发生外渗，形成透明的空腔；处理60 min时，细胞高度变形，细胞壁破裂，细胞质渗漏，菌体死亡。

2.6　‘WZ-44’对2种防治梨火疫病杀菌剂的耐受性

由图11可知，相比于梨火疫病菌‘KL20-28’菌株，‘WZ-44’对中生菌素和春雷霉素盐酸盐均表现较强的耐受性，特别是与春雷霉素盐酸盐表现良好的兼容性。因此，肠膜明串珠菌‘WZ-44’可与春雷霉素盐酸盐协同应用防控梨火疫病。

2.7　肠膜明串珠菌‘WZ-44’菌剂对花期梨火疫病的预防效果

由表3可知，相对于仅接种梨火疫病菌的处理（JZ），‘WZ-44’生防菌剂3×稀释液处理（YF）对花期梨火疫病的预防效果为（76.1±9.6）%，病花率和病叶率分别下降71.0%和56.9%；仅喷施‘WZ-44’生防菌剂3×稀释液处理（CK₁）的叶片和花朵无受害症状。这表明，‘WZ-44’生防菌剂对梨火疫病具有较好的预防效果，且对花期梨树具有较高安全性。

3　讨 论

肠膜明串珠菌广泛分布于植物表面、植物发酵物和土壤中，已被应用于食品、动物饲料、水产病害防治等领域，是一类“通认安全”（generally regarded as safe，GRAS）的益生乳酸菌^［12］。利用包括肠膜明串珠菌在内的乳酸菌防治植物病害已有多个报道， Chakchouk-Mtibaa 等^［14］从发酵橄榄中分离1株肠膜明串珠菌‘YB1’，其对橄榄黄萎病菌和根癌农杆菌具有较强拮抗活性；闫艳华等^［22］研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）‘IMAU10014’对番茄灰霉病菌表现出较强的拮抗活性，病害防效达44%，且能促进番茄种子萌芽和生长。但是，利用乳酸菌防治梨火疫病的研究尚未见报道。本研究从梨火疫病发生果园香梨幼果表面分离筛选到1株肠膜明串珠菌‘WZ-44’，其对梨火疫病菌、亚洲梨火疫病菌、梨锈水病菌等均具有较强的拮抗活性，对梨黑斑病菌、梨炭疽病菌、梨腐烂病病菌具有一定的抑制活性，在梨火疫病等梨树病害防治上表现出较好的抑菌效果。

肠膜明串珠菌可以产生多种抗菌活性物质，如细菌素、有机酸等^［22］。张芯语等^［23］研究发现，肠膜明串珠菌‘MG12’次生代谢物具有较强抗菌活性，且经高温、蛋白酶和紫外照射后仍保留较好的抑菌活性。对筛选到的‘WZ-44’菌株的次生抗菌活性物质特性及其稳定性进行分析发现，‘WZ-44’发酵无菌滤液的拮抗活性优于100 μg/mL噻霉酮和500 μg/mL噻唑锌，与40 μg/mL春雷霉素盐酸盐的抗菌活性相当（图8），并且对高温、蛋白酶以及紫外光照射均具有较好耐受性，稳定性好（图9）。张芯语等^［23］也发现肠膜明串珠菌‘MG12’次生代谢物在pH=4.0时抑菌活性最强，pH=11.0时仍具有较强拮抗活性，相对最高值仅下降20%。本研究发现，‘WZ-44’发酵无菌滤液在pH≤5.0时，拮抗活性较为稳定性，pH≥6.0则完全丧失抗菌活性，但是将失去抗菌活性的发酵无菌滤液的pH调回4.0时，其抗菌活性几乎完全恢复。本研究筛选获得的菌株‘WZ-44’的次生抗菌活性物质表现较好的稳定性和pH可逆性，有利于其抗菌活性物质的分离和生防产品开发。

细胞膜是细菌细胞的重要组成部分，也是细胞执行生物学功能的重要场所。当细胞膜受损时，细胞的生长、代谢受到抑制，细胞内物质甚至会泄漏或聚集，导致细菌死亡。因此，细菌中核酸和蛋白质的泄漏增加可以反映出细胞膜的完整程度。杜琨^［24］发现乳酸菌次生代谢物可破坏金黄色葡萄球菌细胞膜的完整性，造成细胞内容物外泄，甚至菌体崩溃死亡。本研究发现‘WZ-44’产生的次生抗菌活性物质可导致细胞膜的通透性增加或细胞膜破裂，细胞内物质渗漏或聚集，细菌中的核酸和蛋白渗漏逐渐增加等。通过透射电镜观察进一步证实了梨火疫病菌‘KL20-28’的细胞膜完整性受损（图10）。

生物-化学协同防控既可实现对有害生物的稳定高效防控，又可实现农药减量^［25］。仇月等^［26］发现贝莱斯芽孢杆菌‘SDTB038’与肟菌酯、苯醚甲环唑等兼容性好，混合使用可提高其对草莓枯萎病的防效。本研究也发现肠膜明串珠菌‘WZ-44’与防治梨火疫病的春雷霉素盐酸盐具有较好的兼容性，但是，田间联合应用效果还需进一步验证。

4　结 论

本研究从新疆维吾尔自治区库尔勒市梨园香梨上分离到1株对梨火疫病菌、亚洲梨火疫病菌等多种梨树病原菌表现较强拮抗活性的生防细菌‘WZ-44’，基于其菌落菌体形态、生理生化特征及16S rDNA序列鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）。该菌株适宜生长温度范围宽（15~35 ℃），静置发酵培养具有较强产酸能力，与防治梨火疫病的春雷霉素盐酸盐兼容性好；其次生代谢物对热、蛋白酶及紫外照射处理均具有较好稳定性，通过破坏细胞膜完整性快速导致菌体细胞死亡；研制的含0.1%（V/V）吐温80和0.15%（w/V）黄原胶的1.5×10⁹ CFU/mL肠膜明串珠菌‘WZ-44’菌剂对花期梨火疫病预防效果达76.1%，可以替代或部分替代化学农药和农用抗生素。综上，肠膜明串珠菌‘WZ-44’是安全高效防治梨火疫病的生防资源。

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基金资助

国家重点研发计划(2021YFD1400200)

国家梨产业技术体系专项(CARS-28)