腐殖酸类可降解液态膜改善葡萄植株抗寒性的转录组分析

Transcriptome analysis of humic acid-based biodegradable liquid film to improve cold resistance of grapevines

摘要

为探究腐殖酸类可降解液态膜（Biodegradable liquid film，BLF）影响葡萄抗冻性的机制，以酿酒葡萄品种‘赤霞珠’的休眠植株为材料，以喷施BLF为处理组，喷施清水为对照组（CK），通过差热分析评价了BLF处理对抗冻性的影响；对不同低温胁迫条件下的葡萄植株进行转录组测序，通过GO和KEGG富集分析确定关键代谢通路，并进一步对碳水化合物代谢相关酶活性和糖类物质含量进行了测定。结果表明：1）BLF处理降低了葡萄冬芽的过冷却温度和结冰温度。2）在-10 ℃胁迫6 h条件下，CK和BLF组的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）数目最多，共同表达的DEGs主要涉及碳水化合物代谢、次生代谢物合成以及植物激素信号转导等通路。3）CK和BLF处理植株的DEGs共富集到23个显著差异通路（P≤0.05），包括信号转导、脂质代谢、碳水化合物代谢、其他次生代谢物的生物合成以及氨基酸代谢等，其中碳水化合物代谢相关通路在多数胁迫条件下均表现出显著（P≤0.05）或极显著差异（P≤0.01）。4）BLF处理上调了纤维素酶、果胶酶、转化酶基因的表达，下调了β-淀粉酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶基因的表达。5）对酶活性和糖类物质含量的分析结果表明，BLF处理显著提高了低温胁迫下枝条中β-葡萄糖苷酶、总果胶酶和转化酶的活性（P≤0.05），显著提高了枝条的淀粉、可溶性糖及还原糖含量（P≤0.05），显著降低了β-淀粉酶活性及蔗糖含量（P≤0.05）。综上，BLF处理提高了葡萄植株的抗冻性，其主要与碳水化合物代谢通路的变化有关。

Abstract

To study the mechanism of humic acid-based biodegradable liquid film （BLF） affecting the freezing tolerance of grapevines， the dormant vine variety ‘Cabernet Sauvignon’ was taken as material， vines sprayed with BLF as the treatment group， and grapevines sprayed with water as the control group （CK）. Differential thermal analysis was conducted to evaluate the effect of BLF treatment on the freezing tolerance of grapevines. Transcriptome sequencing was performed on grapevines under different low-temperature stress conditions， the key metabolic pathways were identified by GO enrichment and KEGG enrichment analyses， and the activities of enzymes related to carbohydrate metabolism and the content of saccharides were also determined. The results showed that： 1）BLF treatment reduced the supercooling and freezing temperatures of grape winter buds. 2） Under the condition of -10 °C stress for 6 h， the CK and BLF groups had the highest number of differentially expressed genes （DEGs）， and the co-expressed DEGs were mainly related to the pathways of carbohydrate metabolism， secondary metabolite synthesis， and phytohormone signaling. 3） A total of 23 significantly different pathways were enriched in DEGs from CK and BLF-treated plants （P≤0.05）， including signal transduction， lipid metabolism， carbohydrate metabolism， biosynthesis of other secondary metabolites， and amino acid metabolism. Among them， carbohydrate metabolism-related pathways showed significant （P≤0.05） or highly significant （P≤0.01） differences under most stress conditions. 4） BLF treatment up-regulated the expression of genes encoding cellulase， pectinase， and invertase， and down-regulated the expression of genes encoding β-amylase， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， and ethanol dehydrogenase. 5） Further analysis of enzyme activities and sugar contents showed that BLF treatment significantly increased the activities of β-glucosidase， total pectinase and invertase （P≤0.05）， significantly increased the starch， soluble sugar and reducing sugar contents （P≤0.05）， significantly decreased the activity of β-amylase and sucrose content of the branches （P≤0.05）. In conclusion， BLF treatment improved the freezing tolerance of grapevine vines， through the changes in carbohydrate metabolic pathways.

Graphical abstract

关键词

葡萄 / 腐殖酸 / 低温胁迫 / 转录组测序 / 碳水化合物代谢

Key words

grapevine / humic acid / low temperature stress / transcriptome sequencing / carbohydrate metabolism

低温胁迫是植物最重要的非生物胁迫之一。低温限制了植物物种的地理分布，对植物的生长和发育产生了诸多不利影响，包括产量和质量下降、生长迟缓、组织损伤以及生产成本增加^［1-2］。低温胁迫，包括零上低温（0~15 °C）和零下低温（<0 °C）胁迫，主要以2种方式对植物产生伤害：前者是生物膜功能的丧失，后者则是结冰带来的细胞破损和组织脱水。将植物提前暴露在非冰冻低温下，会提高植物对极端低温的耐受性，这就是所谓的冷驯化/抗寒锻炼（Cold acclimation，CA）^［3-4］。冷驯化是植物适应低温胁迫的主要策略之一，涉及多种生理生化过程的复杂变化^［3］。植物可以多种方式向细胞传递冷信号，例如通过钙（Ca²⁺）和活性氧（ROS）信号传导，维持细胞稳态和稳定性^［5］。植物感受低温刺激后进行转录调控，启动与低温胁迫相关基因（CORs），合成应激蛋白，进而控制相关代谢物的合成，主要涉及碳水化合物代谢、脂肪酸去饱和代谢、活性氧清除、抗冻蛋白合成、渗透调节以及光合作用等生理过程^［6-8］。在温度降至冰点以下时，质外体中首先形成冰晶，液态水和冰的化学势之间的差异导致冰晶通过吸收细胞内部的水而生长，发生细胞脱水萎缩，膨胀的冰晶可能导致质膜破裂和细胞死亡^［9］。木本植物进化出深度过冷却机制使其能在冰点温度下存活^［10］，植物组织结冰散热过程中会出现“双冰点”现象，即所谓的二次放热。差热分析/低温放热法（DTA/LTE）通过记录低温胁迫下植物组织内的温度变化，将第2次放热点定义为植物的过冷却点，以此评价其抗寒性^［11-13］。

葡萄是最早驯化的水果，栽培葡萄起源时间大约在距今11 000年前，其栽培适应性较强，是世界范围内栽培最广泛的果树之一^［14］。目前世界上许多优质葡萄酒产区均分布在寒冷气候区，如中国西北部地区、美国中北部各州、中欧、北欧、东欧（俄罗斯和乌克兰）和加拿大。这些产区的冬季寒冷干燥，越冬期最长可达半年，葡萄植株经历CA后暴露在零下温度驯化（Sub-zero acclimation，SZA）中，进一步被冰点下低温（Freezing temperature，FT）胁迫，造成冷冻伤害^［15］。目前生产中最常用的越冬保护措施是埋土防寒，在葡萄秋季落叶后修剪1年生枝条，将葡萄植株从架面上卸下，整株埋入土中，春季重新上架。埋土增加了劳动强度和成本，可能造成主干损伤和病害，限制了机械化生产，且当行间没有覆盖作物时，频繁的起垄操作会破坏生态环境^［16-19］。因此，需要研究其他冬季保护措施的可行性，以实现葡萄酒产业的可持续发展。

有研究称疏水性膜通过阻断外在成核剂的活性，可以使植物过冷至较低的温度，从而提供一定的防冻作用^［20-21］。腐殖酸类物质（Humic acid，HA）是由动物、植物残体在微生物以及地球化学作用下分解和合成的一类天然有机高分子聚合物^［22］，在农业上有广泛的应用。研究表明腐殖酸处理可以提高植物对盐^［23］、水分^［24-25］、高温^［26］等非生物胁迫的耐受性，有明显的抗寒促生效应，可以使轻度受冻植株恢复生长^［27］。适量黄腐酸钾的添加能够提高可溶性蛋白含量，稳定酶活性，减少膜脂氧化产物丙二醛的积累，从而减轻碱性盐及冻融复合胁迫对青稞的伤害，黄腐酸钾的使用还可以降低盐碱和冻融2种胁迫的叠加效应^［28］。Xue等^［29］在陕西合阳地区使用腐殖酸类可降解液态膜（Biodegradable liquid film，BLF）作为越冬保护措施，喷施于葡萄植株表面和行内地面，结果表明BLF处理可以保护‘梅洛’‘爱格丽’‘长相思’和‘贵人香’等品种安全越冬，与传统埋土措施相比，BLF处理延迟了‘赤霞珠’和‘贵人香’葡萄的萌芽，避免了下架、上架、埋土、出土等操作步骤，降低了越冬成本。Han等^［30］研究发现BLF处理提高了低温下葡萄植株的过氧化物酶活性以及可溶性蛋白和可溶性糖含量，上调了低温下ICE-CBF通路中CBF1和CBF3基因表达，改善了葡萄植株的抗寒性。本研究拟以休眠的2年生‘赤霞珠’植株为材料进行室内低温模拟试验，通过构建对照组（CK）和BLF处理组在不同胁迫温度及时间下的36个cDNA文库，探究BLF处理对低温下植株基因表达的影响，分析关键代谢通路，以期明确BLF改善葡萄植株抗冻性的作用机制，旨在为葡萄越冬保护措施的开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

本试验在西北农林科技大学曹辛庄葡萄试验基地进行。试验材料为欧亚种酿酒葡萄‘赤霞珠’（Vitis vinifera L. cv. ‘Cabernet Sauvignon’），将1年生‘赤霞珠’扦插苗于4月份定植在40 cm×30 cm（直径×高）的花盆中，置于田间培养。根据植株长势每株保留1~2根新梢，长到10个叶片高度后进行摘心和去除副梢，无降水情况下浇水（15 d/次）。12月植株休眠后进行处理，一半植株表面喷施BLF，另一半喷施清水作为对照（CK）。每个处理设置3个生物学重复，每个重复3株葡萄。处理一周后，对植株进行模拟低温胁迫试验。

1.2　试验方法

1.2.1　差热分析

参考Kaya等^［31］的方法，稍作修改。首先将PT100温度传感器（上海钰浩电热仪器有限公司）的探针紧贴葡萄冬芽，并用封口膜包裹。采用高低温交变湿热试验箱（YSGJS-408型，上海览浩仪器设备有限公司），以4 °C/h的恒定冷却速率进行降温，冷却温度从4 ℃开始，至-26 ℃结束。采用48通道的R8000无纸记录仪（安徽聚杰科技有限公司），以2 s/次的频率记录冬芽降温曲线。每个处理设置3个生物学重复，每个重复6个冬芽。

1.2.2　转录组测序

以4 ℃/h的速率降温至胁迫温度（-10和-16 ℃），低温处理程序为：30 min从室温（20 ℃）降至4 ℃；在4 ℃保持30 min；以4 ℃/h的速率降温至胁迫温度；持续胁迫24 h，分别于胁迫第3、6、12和24小时进行采样，样品编号见表1。采集1年生枝条基部起第2—5个芽及节间枝条，剥去表皮及芽鳞片后用液氮速冻，储存于-80 ℃冰箱中，用于转录组测序。使用Trizol试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop微量分光光度计和Agilent 2100生物分析仪检测RNA质量。采用NEB#7530试剂盒（北京New England Biolabs公司）进行cDNA文库的构建，然后用QiaQuick PCR提取试剂盒（北京Qiagen公司）纯化cDNA片段，产物经琼脂糖凝胶电泳进行粒度选择，PCR扩增后，由广州基迪奥生物技术有限公司使用Illumina HiSeqTM 2500高通量测序平台进行测序，得到下机原始数据（raw reads）。

利用fastp 18.0对下机的raw reads进行质控，过滤低质量数据，得到clean reads^［32］。使用HISAT2将clean reads映射到参考基因组^［33］，参考Pertea M等^［34］的研究方法，使用StringTie v1.3.1组装每个样本的映射读数，计算FPKM值。

1.2.3　RT-qPCR分析

使用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用Vazyme HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，RNA用量为1 μg，合成cDNA 20 μL。使用Vazyme ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行荧光定量PCR分析，cDNA用量为2 μL/孔，反应体系体积为20 μL。qPCR在qTOWER3G（德国耶拿Analytik Jena公司）上进行。内参基因选择VvACT，根据2^-∆∆Ct法计算基因的相对表达量^［35］，每个样品3次生物学重复和3次技术重复，使用primer 5软件设计特异性引物，详见表2。

1.2.4　碳水化合物代谢相关酶活性及糖类物质含量测定

总果胶酶、纤维素酶（EC 3.2.1.4）、β-淀粉酶（EC 3.2.1.2）、蔗糖酶（EC 3.2.1.26）、磷酸果糖激酶（EC 2.7.1.11）、乙醛脱氢酶（EC 1.2.1.10）和乙醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）的活性测定分别参考北京solarbio公司的BC2630果胶酶活性检测试剂盒、BC2540纤维素酶（CL）活性检测试剂盒、BC2040 β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒、BC0130植物蔗糖酶活性检测试剂盒、BC0530磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒、BC1080乙醇脱氢酶（ADH）活性检测试剂盒和BC0750乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒的方法进行。

1.3　统计分析

使用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行数据处理，2个处理之间的过冷却点和结冰点采用Mann-Whitney U进行独立样本非参数检验，显著性水平为0.05。多个处理之间采用单因素ANOVA进行显著性分析，并进行Duncan多重比较，显著性水平为0.05。图表绘制采用Graphpad Prism 6软件。相关性分析采用派森诺基因云在线数据分析平台进行（https：//www.genescloud.cn），显著性水平为0.05。转录组数据分析采用Omicsmart在线数据分析平台进行（http：//www.omicsmart.com），转录组差异基因分析采用DESeq2软件自带的负二项式模型进行拟合^［36］，使用Wald检验进行显著性检验，并通过Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正，最终筛选FDR（False discovery rate）≤0.05且|log₂ FC|（Fold change）>1的基因为显著差异基因。使用R包模型进行主成分分析（PCA）（http：//www.rproject.org/）。基于GO和KEGG数据库对差异基因进行基因功能注释和显著性富集分析，Q≤0.05为显著富集的GO/KEGG。

2　结果与分析

2.1　差热分析

随着温度下降，降温曲线会出现2个峰，分别是高温放热（High temperature exothermal， HTE）和低温放热（Low temperature exothermal， LTE）。峰的起点为过冷却点，顶点为结冰点，差值为过冷却能力^［37］。冬芽的HTE表示细胞外水分的冻结，LTE表示细胞内水分的冻结。因低温放热峰较小，有时不容易检测到或者被温度的微小波动所掩盖，且高温放热与低温放热相关性极强^［31］，故用高温放热峰的过冷却点及结冰点来衡量枝条抗寒性。图1（a）和（b）分别为CK和BLF处理组在降温过程中的差热分析曲线，二者均出现了高温放热峰值，CK的过冷却温度为-8.5 ℃，结冰温度为-5.6 ℃，BLF的过冷却温度为-11℃，结冰温度为-8.6 ℃。对2个处理组的18个冬芽HTE的过冷却点和结冰点进行统计，结果分别见图1（c）和（d），BLF处理的过冷却温度和结冰温度的中位数均低于CK，即BLF提高了冬芽的过冷却能力，降低了结冰温度。

2.2　转录组差异分析

以|log₂ FC|>1和FDR≤0.05作为基因差异表达的筛选标准，对同一胁迫条件下的CK和BLF处理组植株的转录情况进行比较，筛选的差异表达基因（DEGs）如图2（a）所示。可以看出DEGs数目最多的组是CK-1-2 vs BLF-1-2，共有478个（39个上调，439个下调），其他5组的差异基因数依次为67（CK-1-1 vs BLF-1-1）、279（CK-1-3 vs BLF-1-3）、165（CK-2-1 vs BLF-2-1）、319（CK-2-2 vs BLF-2-2）和451个（CK-2-3 vs BLF-2-3）。在-10 ℃胁迫3、6和12 h下BLF处理分别比CK上调了17、39和140个基因，在-16 ℃胁迫3、6和12 h下则分别上调了24、169和249个基因。在处理时间更长或者温度更低的组中，随着胁迫程度的加深，BLF处理植株有更多的差异基因表现为上调，增加了上调基因/下调基因的比值。对同一温度下的处理组进行主成分分析，结果显示-10 ℃处理下2个主成分PC1和PC2的累积贡献率为81.7 %，其中CK-1-2和BLF-1-1难以区分（图2（b））；-16 ℃处理下的各试验组比-10 ℃的PCA拟合程度更高，2个主成分PC1和PC2的累计贡献率达96.6 %，样本更分散，不同组间有明显区别（图2（c））。

对各比较组的差异基因进行韦恩图分析，在-10 ℃胁迫的3个时间点有13个DEGs（1.85 %）共同表达，其中3 h有264个DEGs特异表达，6 h有650个DEGs特异表达，12 h有548个DEGs特异表达（图2（d））；在-16 ℃胁迫的3个时间点有23个DEGs（3.09 %）共同表达，在3、6和12 h分别有66、208和304个DEGs特异表达（图2（e））。综上，可以看出6和12 h之间的差异基因数目更接近。

对共同表达的DEGs进行分析，-10 ℃下的3个比较组有13个共同差异基因，编码与碳水化合物代谢相关的己糖转运体（STP13）、多聚半乳糖醛酸酶（PG2）、β-1-3葡聚糖酶前体（GNS1）、IV类几丁质酶前体（EP3），以及细胞色素P450家族（CYP716B1）（图3（a））。-16 ℃下的3个比较组有23个共同差异基因，编码与碳水化合物代谢相关的多聚半乳糖醛酸酶（PG2）、乙醇脱氢酶（ADH1）、几丁质酶（CHIT3）、半乳糖醇合成酶（GOLS2），与次生代谢物合成相关的β-淀粉样蛋白合成酶（OSCBPY）、氨基环丙烷羧酸氧化酶（ACO1）、花青素3-O-葡萄糖基转移酶（F3GT2），与脂质代谢相关的3-酮酯酰-CoA合酶（KCS2），与氧化还原相关的过氧化物酶（Os07g0638300），与植物激素信号转导相关的发病相关蛋白（PR1B1）、辅酶诱导蛋白（AUX22），以及硫代硫酸盐硫转移酶（STR17）、醛氧化酶（GLOX1）、硼转运蛋白（BOR4）等（图3（b））。

为检验转录组测序数据的可靠性，随机选择了8个差异表达基因进行RT-qPCR验证。如图4所示，RNA-Seq数据与RT-qPCR结果趋势基本一致，表明测序数据可靠。

2.3　GO和KEGG富集分析

对不同胁迫条件下CK和BLF处理组的差异基因进行GO富集分析，并归类到三大类别中。在生物学过程类别中，差异基因主要富集在代谢过程和细胞过程2个GO term；在分子功能类别中，主要富集在结合和催化活性2个GO term；在细胞组件类别中，细胞、细胞部分、膜、膜部分和细胞器是排名前5位的GO Term，细胞外区也在CK-1-2 vs BLF-1-2和CK-2-3 vs BLF-1-3 2个比较组中富集较多。

对6个比较组的差异基因进行了KEGG富集分析，将存在显著性差异的23个通路进行了分类，结果见表3。这些通路被分配到信号转导、脂质代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、其他次生代谢物的合成、辅助因子和维生素代谢、萜类和聚酮类化合物代谢、能量代谢这8个类别中。其中昼夜节律、α-亚麻酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化、类黄酮的生物合成以及花青素的生物合成这5个通路在多数比较组中均表现出显著（P≤0.05）或极显著差异（P≤0.01），可能是揭示BLF影响葡萄植株低温耐受性的关键通路。

2.4　碳水化合物代谢

2.4.1　编码基因表达

BLF处理显著影响了葡萄植株的碳水化合物代谢，包括细胞壁成分的水解、蔗糖淀粉的转化以及糖酵解过程等，碳水化合物代谢相关的差异表达基因注释通路见图5。细胞壁成分的水解是一个复杂的过程，涉及β-葡萄糖苷酶（β-GC）、内切葡聚糖酶（EG）、果胶酯酶（PME）、聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酸裂解酶（PL）活性的变化。BLF处理提高了β-GC编码基因（VIT_06s0004g01430、VIT_06s0004g01440）和EG编码基因（VIT_18s0089g00210）的表达量，尤其是在-16 ℃胁迫下，BLF-2-3中3个基因的表达量均有显著提高。大部分PME编码基因（VIT_06s0009g02560、VIT_06s0009g02590、VIT_15s0048g00510、VIT_07s0005g00720、VIT_16s0022g00700）的表达量在BLF-2-3中均达到最高，PG基因（VIT_08s0007g07750、VIT_08s0007g07760、VIT_08s0007g07770、VIT_08s0007g07780、VIT_08s0007g08330）亦如此。除细胞壁水解外，可溶性糖的另一个来源是淀粉和蔗糖的转换，主要是转化酶（INV）和β-淀粉酶（β-AL）活性的变化。在不同胁迫条件下，BLF组的INV编码基因（VIT_16s0022g00670）的表达量均高于CK组。与INV相反，CK组的β-AL编码基因（VIT_02s0087g00430）的表达量始终高于BLF组。

蔗糖和淀粉代谢产生葡萄糖（G）和果糖（F）等还原性糖，进入糖酵解过程。果糖-6-磷酸（F-6-P）在果糖磷酸激酶（PFK）的作用下转化为果糖-1，6-二磷酸（F-1，6-BP），PFK5（VIT_14s0108g00540）基因在处理间差异表达，但在CK和BLF组间没有一致规律，CK-1-3中的PFK5表达量显著高于BLF-1-3，但CK-2-3显著低于BLF-2-3。F-1，6-BP转化为甘油醛-3-磷酸（G3P）后分别受到GAPN和GAPC 2种甘油醛-3-磷酸脱氢酶的催化，生成3-磷酸甘油酸。GAPN（VIT_11s0037g00070）和GAPC2（VIT_01s0010g02460）的表达量分别在CK-1-3和CK-2-3中达到最大值，说明在不同的胁迫温度下，糖酵解过程的方向可能存在细微差异。不同处理显著影响了乙醇脱氢酶（ADH）编码基因的表达量，检测到4个ADH基因（VIT_04s0044g01110、VIT_04s0044g01120、VIT_04s0044g01130、VIT_08s0007g01040）差异表达，均在CK-2-3中达到最高，其中变化最大的VIT_04s0044g01130在CK-2-3中的表达量是BLF-2-3的20倍。在整个糖酵解过程中，CK组的各功能酶编码基因相比BLF组表达量更高，说明BLF处理对低温下植株的糖酵解可能存在抑制作用。

2.4.2　代谢酶活性

对碳水化合物代谢途径中6个关键的功能酶活性和代谢物含量进行了测定，结果见图6。与基因表达情况相似，BLF处理显著提高了-10 ℃和-16 ℃胁迫下β-葡萄糖苷酶的活性（P≤0.05），BLF-2-3中的总果胶酶活性也显著高于其他3个处理（P≤0.05），CK-2-3的果胶酶活性次之，这可能与其中PL编码基因（VIT_13s0019g04910）的高表达量有关。在蔗糖淀粉转化过程中，BLF-1-3处理的转化酶活性也高于CK-1-3，但未表现出显著性差异（P>0.05），BLF-2-3处理则显著高于CK-2-3（P≤0.05），CK-2-3组的β-淀粉酶活性显著高于其他3个处理（P≤0.05）。总体来看，低温胁迫下BLF处理促进了蔗糖的转化，而CK组更多地发生了淀粉水解。在糖酵解过程中，4个处理的PFK活性无显著性差异（P>0.05），CK-2-3组的ADH活性显著高于其他3组（P≤0.05）。

2.4.3　糖类物质含量

除了对各功能酶活性和编码基因的检测，还测定了各糖类物质的含量，包括非可溶性糖纤维素、果胶和淀粉的含量，可溶性糖总量，还原糖总量，以及蔗糖的含量，以期从代谢水平上探索不同处理对植株内糖类的影响，结果见图7。BLF-2-3处理的纤维素含量最低，但与CK-2-3无显著差异（P>0.05），-16 ℃胁迫下的植株纤维素含量显著低于-10 ℃（P≤0.05）。不同处理间的总果胶含量无显著差异（P>0.05）。淀粉含量在处理间差异显著（P≤0.05），从高到低依次为BLF-1-3>CK-1-3=BLF-2-3>CK-2-3，即在同一胁迫条件下，BLF处理的淀粉含量更高，与β-淀粉酶的基因表达量和酶活性水平相吻合。在-10 ℃胁迫下，CK和BLF处理植株的蔗糖含量无显著差异（P>0.05），但CK-2-3中的蔗糖含量显著高于BLF-2-3（P≤0.05），说明BLF处理促进了低温胁迫下蔗糖的分解。可溶性糖的含量受温度影响较小，CK和BLF组在2个温度下的水平基本稳定，BLF处理显著提高了植株的可溶性糖总量（CK-1-3 vs BLF-1-3、CK-2-3 vs BLF-2-3）（P≤0.05）。在-10 ℃胁迫下，BLF处理显著提高了植株的还原糖含量（CK-1-3 vs BLF-1-3）（P≤0.05），但在-16 ℃胁迫下二者无显著性差异（CK-2-3 vs BLF-2-3）（P>0.05）。

2.4.4　相关性分析

为探究转录本的变化对植株酶动力和代谢水平的影响，对碳水化合物代谢过程中关键酶的编码基因表达量、酶活性以及糖类物质含量之间进行了Pearson相关性分析，结果如图8所示。整体来看，酶活性与基因表达量之间的相关性更高，且多为正相关关系。总果胶酶活性受基因表达影响最大，与5个PG编码基因表达量均呈显著（P≤0.05）或极显著（P≤0.01）正相关，说明聚半乳糖醛酸酶是主要变化的果胶酶。总果胶酶活性还分别与β-葡萄糖苷酶编码基因（VIT_06s0004g01430、VIT_06s0004g01440）和内切葡聚糖酶编码基因（VIT_18s0089g00210）表达量显著正相关（P≤0.05）。蔗糖转化酶（INV）的酶活性与其编码基因（VIT_16s0022g00670）的表达量呈显著正相关（P≤0.05）。β-葡萄糖苷酶（β-GC）、β-淀粉酶（β-AL）、磷酸果糖激酶（PFK）和乙醇脱氢酶（ADH）这4种功能酶的活性与相关基因表达量均呈正相关关系，但差异不显著（P>0.05）。糖类物质含量与差异基因表达量多呈负相关关系，其中蔗糖含量与INV基因表达量的相关系数达到-1，且在0.001水平下显著。纤维素含量也与2个β-GC基因的表达量呈显著负相关（P≤0.05），相关系数均<-0.95。可溶性糖含量与糖酵解过程中G6PD（VIT_01s0146g00060）、GAPC（VIT_01s0010g02460）、ADH（VIT_04s0044g01110、VIT_04s0044g01120、VIT_04s0044g01130）基因表达量的相关性也较强，相关系数均<-0.75，说明糖酵解过程越活跃，细胞内的可溶性糖消耗越多。

3　讨 论

在低温胁迫下，随着胁迫程度的加深（温度下降或时间延长），CK和BLF组的DEGs总数基本呈上升趋势，但BLF处理植株有更多的差异基因上调，增加了上调基因/下调基因的比值。对CK和BLF处理植株的差异基因进行KEGG富集分析，不同胁迫条件下共富集到23个显著差异通路。在信号转导方面，BLF处理影响了MAPK信号通路、植物-病原物互作和昼夜节律这3个通路。在物质代谢方面，ɑ-亚麻酸代谢、类黄酮合成以及戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化在多数胁迫条件下均存在显著性差异，可能是BLF处理影响植株抗寒性的关键代谢通路。植物适应低温的一个重要因素是碳水化合物的代谢调节，包括糖的前体、中间产物和最终产物在渗透调节、结冰保护和清除ROS方面的作用，以及它们对光合、转运和呼吸等生命活动的影响^［38-39］。已经有诸多研究揭示了低温下植物糖类物质的变化，如细胞壁多糖的水解^［40］，蔗糖、葡萄糖、果糖、棉子糖及阿拉伯糖等可溶性糖的积累^［41-42］，以及糖酵解过程的变化^［43］。

果胶作为植物初生细胞壁和中胶层的主要组分，参与细胞壁结构的支撑和重塑，控制细胞壁孔隙率和细胞粘附，是细胞壁屏障的重要组成部分^［40］。Bilska-Kos^［44］的研究表明，在冷处理下，首先观察到了果胶酯酶（PME）活性的增加，随着处理时间的延长，PME活性下降，低温敏感植株的PME活性下降更快。本研究中，编码PME的8个基因中有6个在BLF处理后上调。冷胁迫同样影响了PG相关的基因的表达^［45］，在山葡萄中冷处理前后的差异可达20倍以上^［8］。本研究中5个PG编码基因的表达量均在冷胁迫加深后出现上调（CK-1-3 vs CK-2-3），且在BLF处理中更高（CK-2-3 vs BLF-2-3）。BLF-2-3处理也显著提高了总果胶酶的活性，可能对HG果胶的去甲酯化修饰产生影响。HG的修饰通过以下3个方面影响植物抗寒性：1）物理屏障。HG的甲基酯化程度可以调节细胞壁的柔韧性，低甲酯化HG可与Ca²⁺交联成“蛋盒”结构，降低细胞壁孔隙率，提高细胞壁硬度，缓冲冰晶膨胀的机械压力，减少低温引起的细胞膜损伤^［46］。2）影响细胞壁-质膜连续体（APMS）的稳定性。果胶代谢异常可能导致质膜与细胞壁分离，加剧细胞渗漏和电解质流失，而耐寒植物通过维持果胶稳态减少冷害。3）信号转导。HG及其降解产物是受体激酶识别以监测细胞壁状态的最佳候选配体，去甲基化的HG可以与受体激酶FERONIA结合，而FERONIA是钙信号的主动传感器，其可能通过与HG或其片段结合来感知细胞壁强度，刺激胞质钙信号来激活驯化反应^［47］，OGs可作为损伤相关分子模式（DAMPs），激活细胞壁关联激酶（WAKs），导致调控细胞胁迫、渗透平衡、细胞壁合成和重构等一系列转录因子的激活^［48-51］。BLF处理对总果胶含量无显著影响，可能更多的影响了果胶的组成，如原果胶和可溶性果胶的比例，甲酯化果胶和去甲酯化果胶的比例等，需要进一步研究。除果胶外，低温下纤维素也被酶水解成可溶性糖，以降低渗透势和细胞液冰点、维持细胞结构稳定^［52］。本研究中，低温下内切葡聚糖酶（EG）和β-葡萄糖苷酶（β-GC）编码基因的表达均有上调（CK-1-3 vs CK-2-3），且在BLF处理中更高（CK-2-3 vs BLF-2-3），可能提高细胞内可溶性糖的含量，进而改善葡萄抗寒性，这与之前的报道一致^［30］。

低温往往会诱导植物体内蔗糖合成速率的上升，但同时伴随着蔗糖降解和蔗糖/淀粉转化的增加，以积累更多的葡萄糖和果糖^［42］。孟德义^［53］研究发现，低温胁迫下冬小麦叶片和根茎中果糖/蔗糖含量的比例增大，说明低温蔗糖转化为果糖，植物体内果糖含量与低温胁迫相联系。本研究中，随胁迫温度的下降，INV基因的表达量上调，且BLF处理的INV表达量比同一条件下的CK植株更高，还观察到了INV酶活性与INV基因表达的显著正相关，蔗糖含量与INV基因表达的显著负相关，说明BLF处理通过上调转化酶基因的表达，提高了酶活性，促进了蔗糖的分解。在非生物胁迫下，植物可能通过抑制糖酵解过程作为一种糖积累的机制，以作为胁迫解除后恢复生长的能量来源^［54］。Khann等^［55］报道了干旱胁迫下果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、3-磷酸甘油酸激酶（PGK）和NADP-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPN）活性下降，而己糖激酶、果糖-6-磷酸激酶（PFK）和NAD-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPC）的活性受影响较小。Muscolo等^［56］的研究表明腐殖质处理抑制了参与葡萄糖代谢的功能酶活性，包括葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、醛缩酶和丙酮酸激酶，从而影响了糖酵解过程。本研究中PFK的编码基因表达和酶活性水平受低温胁迫和处理的影响较小，GAPN的表达量随温度降低下调（CK-1-3 vs CK-2-3），BLF处理降低了低温下GAPN（CK-1-3 vs BLF-1-3）和GAPC（CK-2-3 vs BLF-2-3）的表达量，可能会抑制甘油醛-3-磷酸（G3P）的分解，这可能导致糖酵解循环减缓，减少细胞内糖的消耗，使糖代谢朝着还原糖积累的方向发展。

4　结 论

在BLF处理下，葡萄冬芽的过冷却温度和结冰温度显著降低，植株对低温信号的响应更迅速。在6个低温胁迫条件下，CK与BLF处理组的差异表达基因共富集到23个显著差异通路，其中碳水化合物代谢是关键通路。对基因表达水平、酶活性以及糖类物质含量的分析表明，BLF处理促进了低温下细胞壁成分的水解、蔗糖向淀粉的转化，抑制了糖酵解过程，从而提升葡萄植株的抗冻性。

参考文献

[1] Pearce R. Plant freezing and damage［J］. Annals of Botany， 2001， 87（4）： 417-424

[2] Snyder R L， Melo-Abreu J P D. Frost protection： Fundamentals， practice and economics ［C］. Rome： Food and Agriculture Organization of the United Nations， 2005， 82-87

[3] Chinnusamy V， Zhu J H， Zhu J K. Cold stress regulation of gene expression in plants［J］. Trends in Plant Science， 2007， 12（10）： 444-451

[4] Thomashow M F. Plant cold acclimation： Freezing tolerance genes and regulatory mechanisms［J］. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 1999， 50： 571-599

[5] Ding Y L， Shi Y T， Yang S H. Molecular regulation of plant responses to environmental temperatures［J］. Molecular Plant， 2020， 13（4）： 544-564

[6] 杨慧菊，兰玉倩，王石华.植物响应低温胁迫组学研究进展［J］.山东农业科学，2020， 52（5）：142-148

[7] Yang H J， Lan Y Q， Wang S H. Omics research progress of plant response to low temperature stress［J］. Shandong Agricultural Sciences， 2020， 52（5）： 142-148 （in Chinese）

[8] Wang X C， Zhao Q Y， Ma C L， Zhang Z H， Cao H L， Kong Y M， Yue C， Hao X Y， Chen L， Ma J Q， Jin J Q， Li X， Yang Y J. Global transcriptome profiles of Camellia sinensis during cold acclimation［J］. BMC Genomics， 2013， 14： 415

[9] Xin H P， Zhu W， Wang L N， Xiang Y， Fang L C， Li J T， Sun X M， Wang N， Londo J P， Li S H. Genome wide transcriptional profile analysis of Vitis amurensis and Vitis vinifera in response to cold stress［J］. PLoS One， 2013， 8（3）： e58740

[10] Rajashekar C B， Lafta A. Cell-wall changes and cell tension in response to cold acclimation and exogenous abscisic acid in leaves and cell cultures［J］. Plant Physiology， 1996， 111（2）： 605-612

[11] 郭学民，刘建珍，刘永军，肖啸，高荣孚.木本植物抗寒性概述 ［J］.亚热带植物科学，2014，43（4）：329-338

[12] Guo X M， Liu J Z， Liu Y J， Xiao X， Gao R F. Overview of cold resistance in woody plants［J］. Subtropical Plant Science， 2014， 43（4）： 329-338 （in Chinese）

[13] Mills L J， Ferguson J C， Keller M. Cold-hardiness evaluation of grapevine buds and cane tissues［J］. American Journal of Enology and Viticulture， 2006， 57（2）： 194-200

[14] Kaya O， Kose C. How pretest temperatures change the cold hardiness of grapevine （ Vitis Vinifera L Cv Karaerik） dormant buds？［J］. International Journal of Fruit Science， 2020， 20（S3）： S1470-S1482

[15] Kaya O， Kose C， Donderalp V， Gecim T， Taskın S. Last updates on cell death point， bud death time and exothermic characteristics of flower buds for deciduous fruit species by using differential thermal analysis［J］. Scientia Horticulturae， 2020， 270： 109403

[16] Dong Y， Duan S C， Xia Q J， Liang Z C， Dong X， Margaryan K， Musayev M， Goryslavets S， Zdunić G， Bert P F， Lacombe T， Maul E， Nick P， Bitskinashvili K， Bisztray G D， Drori E， De Lorenzis G， Cunha J， Popescu C F， Arroyo-Garcia R， Arnold C， Ergül A， Zhu Y F， Ma C， Wang S F， Liu S Q， Tang L， Wang C P， Li D W， Pan Y B， Li J X， Yang L， Li X Z， Xiang G S， Yang Z J， Chen B Z， Dai Z W， Wang Y， Arakelyan A， Kuliyev V， Spotar G， Girollet N， Delrot S， Ollat N， This P， Marchal C， Sarah G， Laucou V， Bacilieri R， Röckel F， Guan P Y， Jung A， Riemann M， Ujmajuridze L， Zakalashvili T， Maghradze D， Höhn M， Jahnke G， Kiss E， Deák T， Rahimi O， Hübner S， Grassi F， Mercati F， Sunseri F， Eiras-Dias J， Dumitru A M， Carrasco D， Rodriguez-Izquierdo A， Muñoz G， Uysal T， Özer C， Kazan K， Xu M L， Wang Y Y， Zhu S S， Lu J， Zhao M X， Wang L， Jiu S T， Zhang Y， Sun L， Yang H M， Weiss E， Wang S P， Zhu Y Y， Li S H， Sheng J， Chen W. Dual domestications and origin of traits in grapevine evolution［J］. Science， 2023， 379（6635）： 892-901

[17] Takahashi D， Willick I R， Kasuga J， Livingston Iii D P. Responses of the plant cell wall to sub-zero temperatures： A brief update ［J］. Plant & Cell Physiology， 2021， 62（12）：1858-1866

[18] Jolivet Y， Dubois J M. Evaluation of hilling efficiency as a method of protection of vine against winter cold in Québec ［J］. OENO One， 2016， 34（3）： 83

[19] 王珊. 埋土防寒期葡萄枝条风障对葡萄园生态环境的影响［D］. 杨凌： 西北农林科技大学， 2015

[20] Wang S. Effect of shoots windbreak on vineyard ecotope in soil-buried cold-proof period ［D］. Yangling： Northwest A & F University， 2015 （in Chinese）

[21] 薛婷婷， 韩星， 张红娟， 李华. 埋土防寒区葡萄不同越冬措施的防风沙效应风洞试验研究［J］. 泥沙研究， 2018， 43（05）： 58-64

[22] Xue T T， Han X， Zhang H J， Li H. Study on wind erosion control of grapes by different methods in wind tunnel experiments［J］. Journal of Sediment Research， 2018， 43（5）： 58-64 （in Chinese）

[23] Han X， Xue T T， Liu X， Wang Z L， Zhang L， Wang Y， Yao F， Wang H， Li H. A sustainable viticulture method adapted to the cold climate zone in China［J］. Horticulturae， 2021， 7（6）： 150

[24] Fuller M P， Hamed F， Wisniewski M， Glenn D M. Protection of plants from frost using hydrophobic particle film and acrylic polymer［J］. Annals of Applied Biology， 2003， 143（1）： 93-98

[25] Wisniewski M， Glenn D M， Fuller M P. Use of a hydrophobic particle film as a barrier to extrinsic ice nucleation in tomato plants［J］. Journal of the American Society for Horticultural Science， 2002， 127（3）： 358-364

[26] 李仲谨，李铭杰，王海峰，诸晓峰，苗宗成.腐植酸类物质应用研究进展［J］.化学研究，2009， 20（4）：103-107

[27] Li Z J， Li M J， Wang H F， Zhu X F， Miao Z C. Progress in applied research of humic acids substance［J］. Chemical Research， 2009， 20（4）： 103-107 （in Chinese）

[28] Aydin A， Kant C， Turan M. Humic acid application alleviate salinity stress of bean （ Phaseolus vulgaris L） plants decreasing membrane leakage ［J］. African Journal of Agricultural Research， 2012， 7（7）： 1073-1086

[29] Aguiar N O， Medici L O， Olivares F L， Dobbss L B， Torres-Netto A， Silva S F， Novotny E H， Canellas L P. Metabolic profile and antioxidant responses during drought stress recovery in sugarcane treated with humic acids and endophytic diazotrophic bacteria［J］. Annals of Applied Biology， 2016， 168（2）： 203-213

[30] García A C， Santos L A， Izquierdo F G， Rumjanek V M， Castro R N， dos Santos F S， de Souza L G A， Berbara R L L. Potentialities of vermicompost humic acids to alleviate water stress in rice plants （ Oryza sativa L）［J］. Journal of Geochemical Exploration， 2014， 136： 48-54

[31] Cha J Y， Kang S H， Ali I， Lee S C， Ji M G， Jeong S Y， Shin G I， Kim M G， Jeon J R， Kim W Y. Humic acid enhances heat stress tolerance via transcriptional activation of Heat-Shock Proteins in Arabidopsis ［J］. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 15042

[32] 陆梅.腐殖酸桉树有机专用肥对邓恩桉抗寒促生的效应［J］.浙江林学院学报，2006， 23（5）：501-506

[33] Lu M. Effects of humic acid as special organic fertilizer for Eucalyptus on cold resistance and growth stimulation of Eucalyptus dunnii ［J］. Journal of Zhejiang Forestry College， 2006， 23（5）： 501-506 （in Chinese）

[34] Qu Y， Bao G Z， Pan X Y， Guo J C， Xiang T， Fan X Y， Zhang X， Yang Y N， Yan B R， Zhao H W， Li G M. Resistance of highland barley seedlings to alkaline salt and freeze-thaw stress with the addition of potassium fulvic acid［J］. Plant， Soil and Environment， 2022， 68（7）： 299-308

[35] Xue T T， Han X， Zhang H J， Wang Y， Wang H， Li H. Effects of a biodegradable liquid film on winter chill protection of winegrape cultivars［J］. Scientia Horticulturae， 2019， 246： 398-406

[36] Han X， Yao F， Xue T T， Wang Z L， Wang Y， Cao X， Hui M， Wu D， Li Y H， Wang H， Li H. Sprayed biodegradable liquid film improved the freezing tolerance of cv. Cabernet Sauvignon by up-regulating soluble protein and carbohydrate levels and alleviating oxidative damage［J］. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 1021483

[37] Kaya Ö， Köse C. Determination of resistance to low temperatures of winter buds on lateral shoot present in Karaerik （ Vitis vinifera L） grape cultivar ［J］. Acta Physiologiae Plantarum， 2017， 39（9）： 209

[38] Chen S F， Zhou Y Q， Chen Y R， Gu J. Fastp： An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor ［J］. Bioinformatics， 2018， 34（17）： i884-i890

[39] Kim D， Langmead B， Salzberg S L. HISAT： A fast spliced aligner with low memory requirements［J］. Nature Methods， 2015， 12（4）： 357-360

[40] Pertea M， Pertea G M， Antonescu C M， Chang T C， Mendell J T， Salzberg S L. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads［J］. Nature Biotechnology， 2015， 33（3）： 290-295

[41] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method ［J］. Methods， 2001， 25（4）： 402-408

[42] Love M I， Huber W， Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2［J］. Genome Biology， 2014， 15（12）： 550

[43] 陈仁伟，张晓煜，丁琦，杨豫，南学军，胡宏远，冯蕊，李芳红，张亚红.基于差热分析技术的4个酿酒葡萄品种不同部位抗寒性综合评价［J］.中国生态农业学报：中英文，2020， 28（7）：1022-1032

[44] Chen R W， Zhang X Y， Ding Q， Yang Y， Nan X J， Hu H Y， Feng R， Li F H， Zhang Y H. Comprehensive evaluation of cold resistance in different parts of four wine grape varieties based on different thermal analysis［J］. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2020， 28（7）： 1022-1032 （in Chinese）

[45] Nishizawa A， Yabuta Y， Shigeoka S. Galactinol and raffinose constitute a novel function to protect plants from oxidative damage［J］. Plant Physiology， 2008， 147（3）： 1251-1263

[46] Wang K， Shao X F， Gong Y F， Zhu Y， Wang H F， Zhang X L， Yu D D， Yu F， Qiu Z Y， Lu H. The metabolism of soluble carbohydrates related to chilling injury in peach fruit exposed to cold stress［J］. Postharvest Biology and Technology， 2013， 86： 53-61

[47] Solecka D， Zebrowski J， Kacperska A. Are pectins involved in cold acclimation and de-acclimation of winter oil-seed rape plants？［J］. Annals of Botany， 2008， 101（4）： 521-530

[48] Partelli F L， Vieira H D， Rodrigues A P D， Pais I， Campostrini E， Chaves M M C C， Ramalho J C. Cold induced changes on sugar contents and respiratory enzyme activities in coffee genotypes［J］. Ciência Rural， 2010， 40： 781-786

[49] Shahryar N， Maali-Amiri R. Metabolic acclimation of tetraploid and hexaploid wheats by cold stress-induced carbohydrate accumulation［J］. Journal of Plant Physiology， 2016， 204： 44-53

[50] He X R， Long F Y， Li Y J， Xu Y W， Hu L S， Yao T S， Huang Y Y， Hu D， Yang Y J， Fei Y J. Comparative transcriptome analysis revealing the potential mechanism of low-temperature stress in Machilus microcarpa ［J］. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 900870

[51] Bilska-Kos A， Solecka D， Dziewulska A， Ochodzki P， Jończyk M， Bilski H， Sowiński P. Low temperature caused modifications in the arrangement of cell wall pectins due to changes of osmotic potential of cells of maize leaves （ Zea mays L）［J］. Protoplasma， 2017， 254（2）： 713-724

[52] Sawicki M， Rondeau M， Courteaux B， Rabenoelina F， Guerriero G， Gomès E， Soubigou-Taconnat L， Balzergue S， Clément C， Barka E A， Vaillant-Gaveau N， Jacquard C. On a cold night： Transcriptomics of grapevine flower unveils signal transduction and impacted metabolism［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（5）： 1130

[53] Liu J， Willick I R， Hiraki H， Forand A D， Lawrence J R， Swerhone G D W， Wei Y D， Ghosh S， Lee Y K， Olsen J E， Usadel B， Wormit A， Günl M， Karunakaran C， Dynes J J， Tanino K K. Cold and exogenous calcium alter Allium fistulosum cell wall pectin to depress intracellular freezing temperatures［J］. Journal of Experimental Botany， 2022， 73（11）： 3807-3822

[54] Du J， Anderson C T， Xiao C. Dynamics of pectic homogalacturonan in cellular morphogenesis and adhesion， wall integrity sensing and plant development［J］. Nature Plants， 2022， 8（4）： 332-340

[55] Brutus A， Sicilia F， Macone A， Cervone F， De Lorenzo G. A domain swap approach reveals a role of the plant wall-associated kinase 1 （WAK1） as a receptor of oligogalacturonides ［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2010， 107（20）： 9452-9457

[56] Kohorn B D， Johansen S， Shishido A， Todorova T， Martinez R， Defeo E， Obregon P. Pectin activation of MAP kinase and gene expression is WAK2 dependent［J］. Plant Journal， 2009， 60（6）： 974-982

[57] Kohorn B D， Kohorn S L， Todorova T， Baptiste G， Stansky K， McCullough M. A dominant allele of Arabidopsis pectin-binding wall-associated kinase induces a stress response suppressed by MPK6 but not MPK3 mutations ［J］. Molecular Plant， 2012， 5（4）： 841-851

[58] Willick I R， Takahashi D， Brian Fowler D， Uemura M， Tanino K K. Tissue-specific changes in apoplastic proteins and cell wall structure during cold acclimation of winter wheat crowns［J］. Journal of Experimental Botany， 2018， 69（5）： 1221-1234

[59] Strand Å， Foyer C H， Gustafsson P， Gardeström P， Hurry V. Altering flux through the sucrose biosynthesis pathway in transgenic Arabidopsis thaliana modifies photosynthetic acclimation at low temperatures and the development of freezing tolerance［J］. Plant， Cell & Environment， 2003， 26（4）： 523-535

[60] 孟德义.低温胁迫下冬小麦糖酵解代谢对外源SA的响应［D］.哈尔滨：东北农业大学， 2017

[61] Meng D Y. Glycolysis metabolic mechanism response exogenous salicylic acid under low-temperature of winter wheat［D］. Harbin： Northeast Agricultural University， 2017 （in Chinese）

[62] Echevarría-Zomeño S， Ariza D， Jorge I， Lenz C， Del Campo A， Jorrín J V， Navarro R M. Changes in the protein profile of Quercus ilex leaves in response to drought stress and recovery［J］. Journal of Plant Physiology， 2009， 166（3）： 233-245

[63] Khanna S M， Taxak P C， Jain P K， Saini R， Srinivasan R. Glycolytic enzyme activities and gene expression in Cicer arietinum exposed to water-deficit stress［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2014， 173（8）： 2241-2253

[64] Muscolo A， Panuccio M R， Sidari M， Nardi S. Effect of two different humic substances on some glycolytic enzymes in callus culture of Pinus Laricio［J］. Humic Substance and Environment， 2000， 2： 19-24

基金资助

宁夏自然科学基金项目(2024AAC03085)

国家自然科学基金项目(32460732)

宁夏贺兰山东麓葡萄酒产业技术协同创新中心葡萄酒领域科技人才开放课题