脂肪源间充质干细胞关节内注射治疗马骨关节炎的安全性与临床有效性

Safety and clinical efficacy following intra-articular injection of adipose-derived mesenchymal stem cells in equine osteoarthritis

摘要

马骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是导致运动马跛行和淘汰的重要原因，传统治疗主要以缓解症状为主，但难以改善关节微环境。脂肪源间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cell，AD-MSC）虽然在模型试验中表现出良好的调节作用，但其在临床自然病例中的安全性和疗效仍有待验证。为此，本研究纳入8匹健康马进行14 d安全性观察，纳入10匹自然发病OA患马进行28 d治疗效果评估及随访并进行滑液蛋白组学分析，以评价脂肪源间充质干细胞治疗马骨关节炎的安全性与临床有效性。结果显示；1）健康马注射后14 d内未见全身异常，局部仅出现短暂轻度关节肿胀，48 h内恢复；2）OA患马D28时跛行评分较基线显著下降，D14和D28时局部综合评分均显著降低，D14时滑液总有核细胞计数显著下降；3）治疗前后筛选出125个候选差异表达蛋白，涉及内质网蛋白加工、囊泡运输及能量代谢等过程。综上，AD-MSC关节腔内注射具有良好临床安全性，并可在短期内有效改善跛行症状。本研究为脂肪源间充质干细胞治疗马骨关节炎的临床转化提供了安全性和有效性依据，并为后续深入其作用机制研究及推广应用提供了参考。

Abstract

Equine osteoarthritis is a major cause of lameness and early retirement in athletic horses. Traditional therapies mainly provide symptomatic relief with limited effects on the joint microenvironment， while mesenchymal stem cell–based regenerative strategies show promising regulatory effects in experimental models， but their safety， clinical efficacy， and impact on the joint microenvironment in naturally occurring cases remain to be clarified. In this study， eight healthy horses were enrolled for a 14-day safety observation， and ten horses with naturally occurring OA were included for a 28-day clinical efficacy evaluation and follow-up， along with synovial fluid proteomic analysis， to assess the safety and efficacy of allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cell （AD-MSC） in equine OA. The results showed that：1） No systemic abnormalities were observed within 14 days post‑injection in healthy horses，and only transient mild joint swelling occurred locally， which resolved within 48 hours. 2） In OA horses， lameness scores decreased significantly on day 28， local clinical scores decreased significantly on days 14 and 28， and total nucleated cell count in synovial fluid decreased significantly on day 14. 3） 125 differentially expressed proteins were screened before and after treatment， involving processes such as endoplasmic reticulum protein processing， vesicle transport， and energy metabolism. Overall， AD‑MSCs intra-articular injection has good clinical safety and can effectively improve lameness in a short period of time. Therefore， this study provides evidence for the safety and efficacy of adipose-derived mesenchymal stem cells in the clinical translation for treating equine osteoarthritis， and offers a reference for further investigation of their mechanisms of action and broader application.

Graphical abstract

关键词

马 / 骨关节炎 / 脂肪来源间充质干细胞 / 关节内注射 / 安全性 / 蛋白质组学

Key words

equine / osteoarthritis / adipose-derived mesenchymal stem cells / intra-articular injection / safety / proteomics

马骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是马运动系统常见的慢性退行性疾病之一，可引起关节疼痛、肿胀、活动度下降及持续性跛行，严重影响运动马竞赛能力和服役年限^［1-3］。目前马OA的临床处理仍以厩歇、使用全身性非甾体抗炎药、关节内注射糖皮质激素和透明质酸，以及其他对症支持治疗为主，但现有措施多偏重缓解疼痛和控制炎症，难以有效调节关节内微环境进而对关节健康产生长期有利影响^［3］。在此背景下，具有免疫调节、旁分泌和组织修复潜力的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）逐渐成为OA再生治疗研究的热点^［2，4］。国内已有关于马脐带MSC分离培养及生物学特性的研究^［5］，也有同种异体脂肪来源MSC治疗自然发病马OA的探索性报道^［6］，但尚未在临床病例上开展系统性应用研究。目前国际上针对马OA的MSC治疗已开展相关研究，但尚未针对MSC调节OA关节内微环境进行临床探究。健康关节和马体内模型研究证实，采用不同组织来源、细胞剂量及给药方案的MSC进行关节腔内注射整体具有良好安全性，但不同研究报道的局部炎症反应及免疫应答结果存在一定差异^［7-12］。骨髓源、脐带源及脂肪源MSC均被证实可在不同程度上改善患者跛行程度、关节屈曲反应、关节积液状况及运动功能恢复水平等指标^［13-17］。然而，现有研究在细胞来源、制备工艺、病例类型、给药频次、随访周期及评价指标等方面存在较大差异，针对自然发病病例采用同种异体脂肪源MSC治疗的安全性与疗效仍需更多临床证据。

关节滑液可直接反映关节局部微环境的动态变化，相较于血液等全身性样本，更能准确表征滑膜炎症、软骨基质代谢及关节腔内分子变化^［18］。既往蛋白质组学研究表明，健康马与OA患马的滑液蛋白表达谱存在显著差异，并可用于筛选潜在生物标志物和进行疾病严重程度分级^［19-21］。另有研究指出，MSC对OA的干预作用更可能体现为对关节局部微环境的整体调控，而非单一因子的简单调控^［4，22］。基于此，本研究旨在以健康马为对象评价同种异体脂肪来源MSC（Adipose-derived mesenchymal stem cell，AD-MSC）关节腔注射的安全性，进而观察其对自然发病OA患马的短期临床疗效及滑液常规指标的影响，并结合滑液蛋白质组学分析初步阐释治疗后关节局部微环境的变化特征，以期为AD-MSC在马OA中的临床应用与推广提供参考依据。

1　材料与方法

1.1　研究设计与动物入组

本研究为一项包含两阶段的前瞻性临床试验。第一阶段为健康马安全性评价，第二阶段为自然发病OA患马临床疗效评价。

1.1.1　安全性评价阶段

纳入临床健康马8匹，用于评价同种异体马源AD-MSC关节腔内注射的安全性。纳入标准包括：临床检查无明显异常，无系统性疾病史；试验关节无跛行表现（AAEP评分0分），无关节积液、无触诊疼痛或敏感，关节活动范围正常；试验关节无既往关节疾病史、手术史或急性损伤史；试验前至少4周内未接受过任何关节内注射治疗；试验前至少4周内未使用过非甾体抗炎药或其他抗关节炎药物。

1.1.2　疗效评价阶段

纳入自然发病OA患马10匹，用于短期临床疗效评价。纳入标准包括：跛行持续超过4周，并经关节阻断及X线检查确定由OA所致；但无关节间隙明显狭窄或重度OA改变；AAEP跛行评分≥3分；或跛行评分为2分，但关节局部评分中“触诊疼痛”或“关节积液”或“关节活动范围”至少有一项达到2分；试验前4周内未接受非甾体抗炎药、糖胺聚糖或其他抗关节炎药物治疗，且未接受任何物理治疗（包括针灸、冲击波等）；试验前4周内未接受过口服、全身或关节内注射皮质类固醇。

排除标准包括：X线检查显示关节间隙明显狭窄或重度OA改变（如严重骨赘形成、软骨下骨硬化或囊肿样变）；既往接受过干细胞治疗；合并多发性关节炎或其他可导致跛行的骨科或神经肌肉疾病。

1.2　试验动物与分组

本研究纳入临床健康马8匹，用于同种异体AD-MSC关节腔内注射的安全性评价；另纳入自然发病OA患马10匹，用于短期临床疗效评价，健康马与自然发病OA患马均于D0接受单次AD-MSC关节腔内注射。试验期间所有受试马在相对一致的饲养管理条件下观察，自由饮水并按常规制度饲喂。

1.3　主要试剂与仪器

主要试剂包括同种异体马源AD-MSC悬液来自觅投克（北京）生物医学技术有限公司，二喹啉甲酸法（Bicinchoninic acid assay，BCA）蛋白定量试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，马用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司。蛋白质组学样本前处理采用Majorbio microprotein kit完成。主要仪器包括Abaxis VetScan HM5全自动血细胞分析仪，购自美国硕腾公司；Varioskan LUX多功能酶标仪、Vanquish Neo高效液相色谱系统及Orbitrap Astral质谱仪，均来自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.4　AD-MSC关节腔内注射

在严格无菌条件下，健康马匹统一选择左前掌指关节进行安全性测试。采用无菌操作向目标关节内单次注入AD-MSC细胞悬液3 mL，总细胞数为3×10⁷个，注射当日记为D0。

1.5　临床评价

安全性指标包括精神状态、食欲、直肠温度、心率、呼吸频率、跛行评分、关节局部反应评分及滑液实验室指标；疗效评价指标包括跛行评分、关节局部反应评分、滑液实验室指标及滑液蛋白质组学。

安全性评价中，精神状态和食欲于注射前及注射后D0至D14每天观察，直肠温度、心率和呼吸频率于D0至D7以及D14监测。跛行程度采用改良AAEP评分系统（5分制，0.5分增量）进行评估^{［17，23］}。关节局部反应评分参考既往马关节炎与滑膜炎相关研究中的临床评价项目进行整理^{［15，24］}，评价内容包括局部皮温、触诊疼痛程度、关节活动范围、关节肿胀程度及对关节屈曲的反应（表1）。跛行评分和关节局部反应评分均在D0至D7以及D14进行评分。

疗效评价中，OA患马于D0、D14及D28进行跛行评分、关节局部反应评分，其中D28用于评估治疗后临床改善的持续情况。

1.6　滑液样本采集与炎性指标检测

健康马与OA患马均于D0注射AD-MSC前和注射D14后在无菌条件下采集受试关节滑液样本。采样前对穿刺部位进行常规剃毛和消毒，关节穿刺后抽取滑液约2 mL。

健康马滑液样本检测指标包括总有核细胞计数（Total nucleated cell count，TNCC）、总蛋白（Total protein，TP）、前列腺素E₂（Prostaglandin E_，PGE₂）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A，SAA）。其中，TNCC采用全自动血细胞分析仪检测，TP采用BCA法测定，PGE₂、IL-1β和SAA采用ELISA试剂盒检测。

OA患马滑液样本检测指标包括TNCC和TP，检测方法同上。

1.7　滑液蛋白组学分析

9匹OA患马收集到治疗前后关节滑液，治疗前滑液样本记为D0组（n=9），治疗后D14滑液样本记为D14组（n=9）。滑液样本蛋白提取、多肽制备及质谱检测均按Majorbio microprotein kit标准流程进行。滑液样本经蛋白提取、还原、烷基化和胰蛋白酶酶解后，采用C18 Tip脱盐，真空浓缩后以0.1%甲酸复溶。肽段样本经Vanquish Neo高效液相色谱系统分离后，进入Orbitrap Astral质谱仪，以DIA模式进行采集。

原始数据采用Spectronaut 19软件进行数据库检索与定量分析，检索数据库为Equus caballus UniProt数据库。蛋白表达矩阵经log₂转换后用于后续分析。采用配对Wilcoxon符号秩检验对D0组与D14组进行差异分析。以raw P<0.05且|log₂FC|>0.585作为候选差异表达蛋白筛选阈值。基于候选差异表达蛋白进行基因本体（Gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，并基于全蛋白排序结果进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis，GSEA）。

1.8　统计学分析

统计分析采用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad Software， USA）完成。临床相关图形在Python 3.14环境下，采用matplotlib 3.10.8绘制。蛋白质组学数据上传至云平台（cloud.majorbio.com）进行后续分析，差异表达蛋白筛选、GO和KEGG富集分析及GSEA分析均在云平台完成，相关组学图形由平台生成。连续型数据首先进行正态性检验，符合正态分布的数据以均值±标准差表示，采用配对t检验；不符合正态分布的数据以中位数（四分位数间距）表示，采用Wilcoxon符号秩检验。跛行评分及关节局部评分在D0、D14和D28间的比较采用Friedman检验，事后两两比较采用Dunn多重比较检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果与分析

2.1　AD-MSC关节腔内注射的安全性

为评价同种异体AD-MSC关节腔内注射的安全性，对健康马注射后的全身临床表现、局部关节反应及滑液相关指标进行了7 d的连续观察。结果显示，观察期内，试验马精神状态良好，采食及饮水正常，未见与注射相关的全身性过敏反应或明显行为异常。各监测时间点的直肠温度、心率和呼吸频率总体平稳，均处于正常生理范围内（图1（a））。

局部临床观察结果显示，所有健康马注射前后跛行评分均为0分，关节活动范围未见明显异常。注射后24 h，少数马出现轻度关节积液或轻微触诊敏感，评分均不超过1分；上述变化未进行任何干预，于48 h内自行消退。至D14时，各项局部临床指标均保持在基线水平，未见持续性关节肿胀、触诊敏感或运动功能障碍。

滑液指标检测结果显示，D14时滑液TNCC与TP与注射前相比差异均无统计学显著差异（P>0.05，图1（b），图1（c））。其中，TNCC在注射前后均维持于0.1×10⁹ 个/L以下，TP测定值均未超过2.5 g/dL。因穿刺过程引起医源性血液污染，剔除2份失真样本后，最终有效统计样本量为6匹。上述结果表明，单次关节腔内注射AD-MSC未引起滑液TNCC与TP显著变化。

滑液炎症相关因子检测结果显示，IL-1β在所有注射前后样本中均低于检测下限。SAA和PGE₂在注射前后均差异不显著（P>0.05，图1（d），图1（e））。结合全身、局部及滑液相关指标变化，在本研究观察期内，同种异体AD-MSC关节腔内注射未见明显不良反应，提示其具有较好的安全性。

2.2　AD-MSC治疗自然发病OA患马的短期临床疗效

为评价AD-MSC对自然发病OA患马的短期临床疗效，对患马跛行评分、关节局部评分及滑液常规指标进行分析。结果显示，患马跛行评分在治疗后显著降低。D0、D14和D28时跛行评分中位数分别为3.0、2.0和2.0分。Friedman检验显示各时点间总体差异具有统计学意义（P=0.000 5），事后检验提示D28时跛行评分较D0显著降低（P=0.015 6）（图2（a））。结果提示AD-MSC治疗后患马跛行程度在28 d内总体有所改善。

关节局部评分结果显示，D0、D14和D28时局部综合评分中位数分别为2、1和1分，整体呈下降趋势。Friedman检验提示各时点间总体差异具有统计学意义（P=0.000 3），事后检验显示D14和D28时局部综合评分均显著低于D0（P=0.021 9，P=0.007 6），而D14与D28之间差异无统计学显著性（图2（b）），提示治疗后患马关节局部临床表现较基线有显著缓解。

滑液细胞学及理化指标检测结果显示，D14时滑液TNCC较治疗前显著降低（P=0.0156，图2（c））。滑液TP在D14时较治疗前略有升高，但差异不显著（图2（d））。上述结果表明，AD-MSC治疗后患马滑液细胞学指标有所改善，而TP在短期内未见明显变化。

综上，在本研究观察期内，AD-MSC关节腔内注射可在一定程度上改善自然发病OA患马的临床症状，并伴随滑液TNCC下降，提示其短期临床疗效较为显著。

2.3　AD-MSC治疗前后滑液蛋白组学变化特征

为评估AD-MSC治疗前后OA马滑液蛋白表达谱的变化，对A组与B组样本进行了差异表达蛋白筛选及功能富集分析。以raw P<0.05且|log₂FC|>0.585为筛选阈值，D0组相比D14组共获得125个候选差异表达蛋白，其中上调蛋白18个，下调蛋白107个（图3（a））。总体来看，D0组与D14组之间存在一定蛋白表达差异，但差异蛋白以下调为主。

对上述候选差异表达蛋白进行GO富集分析。结果显示，D0组与D14组比较所得蛋白在生物过程中主要涉及细胞周期负调控、细胞周期时相转换负调控、高尔基体囊泡运输、内质网应激反应、mRNA代谢过程调控及细胞内运输等；在细胞组分中主要富集于膜蛋白复合物和胞吐囊泡（图3（b））。上述结果表明，AD-MSC治疗后滑液蛋白变化主要与细胞周期调控、蛋白转运及内质网应激相关过程有关。

进一步对候选差异表达蛋白进行KEGG通路富集分析。结果显示，D0组与D14组比较所得蛋白主要富集于内质网蛋白加工、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸延长、柠檬酸循环及产热等通路（图3（c））。富集通路主要涉及蛋白质加工稳态及能量代谢、脂质代谢相关过程，提示AD-MSC治疗后滑液微环境可能发生一定程度的功能重塑。

为进一步从全蛋白表达谱层面评价AD-MSC治疗前后功能特征的变化，对D0组与D14组进行了GSEA分析。结果显示，以校正后P<0.25为筛选标准，肥厚型心肌病通路达到显著富集，且呈负向富集趋势（NES<0，图4）。此外，内质网蛋白加工、补体和凝血级联、吞噬体及产热等通路亦呈现一定富集趋势。综合候选差异表达蛋白筛选、GO、KEGG及GSEA结果可见，D0组与D14组蛋白表达变化主要集中于内质网蛋白加工、物质转运及代谢相关功能模块。

3　讨 论

对于运动马匹，OA治疗目标不仅是缓解症状，而在于促进关节健康并延长服役年限。OA的病因复杂，无论是正常关节承受异常负荷，还是受损关节承受慢性压力，都使得临床上亟需一种既能缓解症状、又可能促进关节健康的疗法。本研究分别从健康马使用后的安全性、自然发病OA患马短期临床效果及关节滑液内环境变化3个层面评价了同种异体AD-MSC关节腔内注射后的表现。

安全性结果显示，健康马在14 d观察期内未见明显全身异常，局部仅出现轻微且短暂的关节积液和触诊敏感，并于48 h内自行消退；跛行评分始终维持在0分，滑液TNCC、TP、PGE₂、SAA及IL-1β亦未见持续性异常，提示该制剂在本研究条件下具有较好的安全性和局部生物相容性。该结果与既往健康马MSC关节内注射研究的总体结论一致，即系统性不良反应并不突出，安全性评价重点更多在局部反应及滑液学变化方面^［7，14］。从局部反应来看，本研究仅个别马匹在注射后早期出现轻度关节积液和轻微触诊敏感，未伴随跛行或关节活动范围受限等异常，滑液TNCC和TP在D14均未见显著升高。上述注射后反应更可能是由于关节注射造成的短暂机械刺激，而非AD-MSC引起的不良反应。先前研究报道，健康马关节腔注射MSC后可出现轻度关节肿胀、滑液增多表现，通常无需干预即可自行恢复^［8］，亦有研究观察到注射后局部皮温升高或一过性跛行，且此类反应与对照组相比无显著统计学差异^［15］。与上述研究相比，本研究局部反应程度较轻、持续时间较短，提示在本试验条件下AD-MSC具有较好的局部耐受性。

在自然发病OA患马中，AD-MSC治疗后的短期改善主要体现在临床评分和滑液TNCC。跛行评分于D28较基线显著下降，而局部综合评分在D14和D28时均较D0显著降低，提示局部炎症相关体征的改善早于整体运动功能恢复。既往研究亦表明，MSC治疗后跛行、屈曲反应和整体临床评分可随随访时间延长逐步改善^［14-16］。本研究中仍有个别患马改善不明显，提示自然发病OA病例间仍存在较强异质性，治疗反应可能受病程、病变程度及既往管理等因素影响。

滑液常规指标的变化为疗效判断提供了客观依据。本研究中TNCC于D14显著下降，而TP未见显著变化。TNCC更直接反映关节腔内细胞性炎症程度，而TP还会受到滑膜通透性、蛋白渗出及慢性结构改变等因素影响^［25］。既往研究提示，自然发病OA关节的TNCC和TP与健康关节之间可有较大重叠，而在急性滑膜炎模型中，MSC对TNCC的改善往往早于其他指标恢复^{［9，12，26-27］}。因此，本研究结果可能提示AD-MSC的短期效应可能首先体现为对细胞性炎症的调节，而对滑膜通透性相关变化的影响尚未在D14充分显现。

蛋白组学结果则从分子层面提示了治疗后关节微环境的变化情况，治疗前后滑液蛋白变化主要涉及内质网蛋白加工、囊泡与物质转运以及能量代谢、脂质代谢等功能模块。结合既往研究，滑液是反映关节局部病理状态的重要分子信息来源，MSC可通过旁分泌、免疫调节和微环境重塑等多个方面共同调节OA的关节微环境^{［4，19，28］}。已有研究表明，细胞的内质网蛋白加工在减轻软骨细胞凋亡压力方面具有重要作用^［29］，因此MSC可能通过调节内质网蛋白加工，从而发挥软骨保护作用。同时，有研究表明，补体系统的激活可促进炎症反应及软骨降解，而抑制补体活化可减轻滑膜炎症并改善关节功能^［30］，因此GSEA揭示补体与凝血级联通路的下调，从分子水平为临床观察到的滑液TNCC下降及跛行评分改善提供了依据，提示了MSC的局部免疫调节功能。此外，骨关节炎过程中滑液代谢物谱往往发生显著改变，涉及多种能量代谢相关通路^［21］，因此能量代谢、脂质代谢的变化可能与关节腔代谢稳态的改变有关。

本研究仍存在一定局限。首先，疗效评估时长为14 d，随访至28 d，整体仍属于较短观察窗口，因此对长期疗效和关节内微环境调节的判断仍有限。其次，本研究马匹数量有限，尤其在滑液蛋白组学分析中，剔除失真样本后仅纳入9匹马的数据，样本量相对较小，可能影响差异蛋白筛选结果的稳定性。同时，有限的样本量也可能限制本研究对不同病程阶段或不同病变程度OA患马的代表性分析。未来应在更多OA临床病例中开展研究，并结合更长随访时间，更系统总结AD-MSC治疗马OA的临床疗效。

4　结 论

本研究分别从健康马安全性、自然发病OA患马短期临床疗效及滑液蛋白组学变化3个层面，对同种异体AD-MSC关节腔内注射后的表现进行了评价。结果显示，同种异体AD-MSC关节腔内注射在健康马中表现出较好的安全性，在自然发病OA患马中显示出一定的短期临床改善效果，AD-MSC干预后滑液蛋白变化主要涉及内质网蛋白加工、囊泡与物质转运以及能量代谢、脂质代谢等功能模块，提示AD-MSC对关节微环境具有一定程度的功能性调节。

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基金资助

新疆人才发展基金(ZZYD2025010)