绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白对线粒体动力学相关因子表达的影响

Impact of Jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein (JSRV Env) on mitochondrial dynamics homeostasis

摘要

为分析绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）对线粒体动力学相关因子表达变化的影响，本研究将自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞作为研究对象，分别采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印迹法（WB）检测线粒体动力学相关因子DRP1、p-DRP1（Ser616）、MFF、MFN2、OPA1的mRNA和蛋白相对表达水平，利用细胞免疫荧光（IF）试验观察JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体分布及DRP1向线粒体移位情况，采用WB检测JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体和胞质亚组分蛋白中DRP1和DRP1 Ser616位点的磷酸化蛋白相对表达水平。结果表明：1）与健康组相比，自然感染JSRV羊肺组织中线粒体分裂相关因子DRP1（P<0.001）和MFF（P<0.01）的mRNA水平与DRP1（P<0.001）、p-DRP1（Ser616）（P<0.001）和MFF（P<0.05）蛋白相对表达水平均显著上调；线粒体融合相关因子MFN2、OPA1的mRNA水平（P<0.001）和MFN2、OPA1的蛋白相对表达水平均显著下调（P<0.05）。2）相较于Blank组和Negative control组，JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体分裂相关因子DRP1和MFF的mRNA水平（P<0.001）与DRP1、p-DRP1（Ser616）和MFF蛋白相对表达水平在24、48和72 h时均显著上调（P<0.01）；线粒体融合相关因子OPA1、MFN2的mRNA水平（P<0.01）与OPA1和MFN2蛋白相对表达水平在24、48和72 h时均显著下调（P<0.05）。3）激光共聚焦显微镜显示，相较于Blank组和Negative control组，JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中线粒体网络结构被破坏，线粒体结构异常，呈碎片化、颗粒状或点状。p-DRP1（Ser616）与线粒体的共定位水平增加，且p-DRP1（Ser616）在线粒体亚组分蛋白中的相对表达水平显著上调（P<0.001）。综上，本研究发现自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中均发生线粒体分裂水平上调而融合水平下调的线粒体动力学紊乱现象，通过分析JSRV转化细胞后细胞超微结构中线粒体动力学变化情况，为JSRV致病机制提供新的研究视角。

Abstract

To analyze the effect of Jaagsiekte sheep retrovirus （JSRV） on the expression alterations of mitochondrial dynamics-related factors， the study used naturally infected JSRV sheep lung tissue and JSRV Env-transformed human bronchial epithelial cells （BEAS-2B） cells as research objects. and in Real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR） and Western blotting （WB） were utilized to detect the relative mRNA and protein expression levels of mitochondrial dynamics-related factors， including DRP1， DRP1 （Ser616）， MFF， MFN2， and OPA1. Immunofluorescence （IF） assay was performed to observe mitochondrial distribution and the mitochondrial translocation of DRP1 in JSRV Env-transformed BEAS-2B cells. Additionally， WB was used to detect the relative expression levels of DRP1 and phosphorylated DRP1 at the Ser616 site in mitochondrial and cytoplasmic subfraction proteins of JSRV Env-transformed BEAS-2B cells. The results demonstrated the followings： 1） Compared with the healthy control group， the mRNA levels of mitochondrial fission-related factors DRP1 （P<0.001） and MFF （P<0.01）， as well as the relative protein expression levels of DRP1 （P<0.001）， p-DRP1 （Ser616） （P<0.001）， and MFF （P<0.05）， were significantly upregulated in the lung tissues of JSRV-naturally infected sheep. The mRNA levels of mitochondrial fusion-related factors MFN2 and OPA1 （P<0.001） and their relative protein expression levels were significantly downregulated （P<0.05）. 2） Compared with the blank group and negative control group， the mRNA levels of DRP1 and MFF （P<0.001） and the relative protein expression levels of DRP1， p-DRP1 （Ser616）， and MFF in JSRV Env-transformed BEAS-2B cells were significantly upregulated at 24， 48， and 72 h （P<0.01）. The mRNA levels of OPA1 and MFN2（P<0.01） and their relative protein expression levels were significantly downregulated at 24， 48 and 72 h（P<0.05）. 3） Laser confocal microscopy revealed that the mitochondrial network structure in JSRV Env-transformed BEAS-2B cells was disrupted， with mitochondria exhibiting abnormal fragmented， granular， or punctate morphology. Moreover， the colocalization level of p-DRP1 （Ser616） with mitochondria was increased， and the relative expression level of p-DRP1 （Ser616） in mitochondrial subfraction proteins was significantly upregulated （P<0.001）. In conclusion， this study found that mitochondrial dynamics disorder， characterized by upregulated mitochondrial fission and downregulated mitochondrial fusion， occurred in both JSRV-naturally infected sheep lung tissues and JSRV Env-transformed BEAS-2B cells. This research elucidates the changes in mitochondrial dynamics within the ultrastructure of cells following JSRV transformation， thereby providing a novel perspective for investigating the pathogenic mechanism of JSRV.

Graphical abstract

关键词

绵羊肺腺瘤病毒 / 线粒体动力学 / 线粒体分裂 / 线粒体融合

Key words

Jaagsiekte sheep retrovirus （JSRV） / mitochondrial dynamics / mitochondrial fission / mitochondrial fusion

绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）是介导绵羊肺腺瘤（Ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA）的病原，可以引起绵羊慢性、进行性、传染性肺肿瘤疾病。病羊多以死亡告终，严重影响了养羊业的健康高效发展，目前针对JSRV的感染还没有有效的防控措施^［1］。

JSRV是单股正链RNA病毒，属于逆转录病毒科、β逆转录病毒属，其基本基因结构包括gag、pro、pol和env。其中，囊膜基因（env）编码的囊膜（Envelope，Env）蛋白作为关键的致癌蛋白能够诱导宿主细胞发生恶性转化^［2］。已有大量研究结果表明，JSRV Env可以诱导多种类型的细胞模型发生恶性转化^［3-7］。BEAS-2B细胞源于人支气管上皮组织，与JSRV攻击的肺泡II型上皮细胞和细支气管上皮细胞来源高度一致，并且JSRV引起的肺腺癌已被证实可能与人类肺腺癌在形态上存在一定相似性^［8-9］，这使得BEAS-2B细胞成为JSRV Env恶性转化的经典细胞模型。

由于病毒没有进行能量代谢的生理机制，通常必须寄生在活细胞中才能行使其功能，因此，线粒体常成为病毒入侵的靶点^［10］。本课题组长期致力于JSRV Env致病机制的研究，在前期研究中发现自然感染JSRV病肺组织中存在线粒体数量减少、线粒体肿胀和空泡样病变的形态结构严重受损现象，随后受损线粒体以线粒体自噬的方式清除^［11］；且JSRV Env转化BEAS-2B细胞中也发现线粒体损伤及线粒体自噬的现象^［12］。这一发现表明JSRV对线粒体功能有一定的调控作用，导致线粒体功能障碍，进而可能加剧细胞损伤和死亡。同时也使得研究JSRV感染可能如何通过影响线粒体功能来促进疾病的发展至关重要。越来越多的研究发现病毒入侵后宿主细胞线粒体形态和功能严重受损，并且可以直接靶向线粒体动力学相关蛋白，破坏线粒体分裂与融合的平衡机制，导致线粒体功能障碍，从而影响细胞能量生成和代谢过程，为病毒增殖创造了有利的细胞内环境。线粒体动力学中线粒体融合主要由线粒体融合蛋白1（Mitofusin 1，MFN1）、线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）和视神经萎缩蛋白1（Optic atrophy protein 1，OPA1）介导^［13］。介导线粒体分裂的主要蛋白为动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1，DRP1），而线粒体分裂因子（Mitochondrial fission factor，MFF）和线粒体分裂蛋白1（Mitochondrial fission protein 1，FIS1）等充当线粒体上DRP1的受体，辅助DRP1募集到线粒体上^［14］。在单股正链RNA病毒的研究中，丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是破坏线粒体功能的重要病毒之一，其核心蛋白可以定位于线粒体外膜，在HCV感染的细胞中观察到超微结构下线粒体肿胀、嵴消失等线粒体网络结构破坏现象，且DRP1 Ser616位点的磷酸化诱导的线粒体异常分裂使线粒体以碎片化形式存在，最终导致线粒体动力学失衡及线粒体功能障碍^［15］。Sun等^［16］在猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的研究中观察到超微结构下线粒体发生肿胀变形、嵴结构模糊及空泡化现象，同时线粒体网络结构被破坏，进而通过促进线粒体分裂、抑制线粒体融合来扰乱线粒体动力学平衡，引起线粒体功能障碍，从而调控有利于自身存活的条件。因此，深入研究病毒感染扰乱宿主细胞线粒体动力学平衡具有重要意义，一些病毒在与宿主共进化的过程中已经发展出不同的策略来操纵宿主细胞线粒体动态平衡，导致线粒体功能障碍，加剧细胞损伤和死亡，从而促进疾病的发展。

尽管前人在多种病毒研究中对线粒体动力学机制展开深入研究，本课题组针对线粒体损伤和线粒体自噬的研究也取得了一定进展，但目前对线粒体功能障碍的研究还不够深入，线粒体动力学在其中起到的作用还未揭示，在JSRV致病机制的相关研究较为有限。本研究对自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体动力相关因子表达以及线粒体分裂和融合情况进行分析，旨在深入了解JSRV Env对宿主细胞线粒体动力学的干扰规律，并初步探讨这一现象与BEAS-2B细胞恶性转化的潜在关联，以期为理解JSRV的致病机理和寻找新的防控切入点提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　细胞与质粒

人支气管上皮（BEAS-2B）细胞由本实验室保存；pcDNA4.0/myc-His-JSRV-env重组质粒、pcDNA4.0/myc-His载体均由本实验室保存。

1.1.2　组织样品

将采自内蒙古自治区乌兰察布市某养殖场的绵羊肺组织样本放入冻存管中保存在液氮中，然后放至-80 ℃保存^［10］。

1.1.3　主要试剂

DMEM、0.25%胰酶、青霉素-链霉素双抗溶液、无钙镁的磷酸盐缓冲液、Opti-MEM购自GIBCO；Lipofectamine^TM 3 000购自Thermo Fisher Scientific；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自上海雅酶生物公司；TRIzol购自Takara公司；反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；全蛋白提取试剂盒、Hoechst33342核染料购自生工生物工程股份有限公司；BCA试剂盒、线粒体蛋白提取试剂盒、Mitotracker绿色荧光染料购自上海碧云天生物技术有限公司；DRP1、p-DRP1（Ser616）一抗购自Abcam公司；MFF、MFN2、OPA1、His、β-actin、VDAC1、TOMM20、HRP标记的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　引物设计及合成

参照NCBI数据库中收录的JSRV env和β-actin、DRP1、MFF、MFN2、OPA1的基因序列进行综合分析，Primer Premier 6.0设计RT-qPCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.2　细胞培养

复苏BEAS-2B细胞，接种到含10% FBS和1%青霉素-链霉素双抗溶液的DMEM细胞完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中进行培养，待汇合度约90%进行传代培养。

1.2.3　BEAS-2B细胞转染 JSRV-env重组质粒

将BEAS-2B细胞接种于6孔板中，放置细胞培养箱中培养。待细胞汇合度达70%~80%时参照Lipo3 000转染试剂说明书进行转染。简要步骤如下：A液：将5 μL Lipo3 000试剂用125 μL Opti-MEM培养基稀释后轻轻混匀；B液：将2.5 μg质粒和5 μL P3 000试剂用125 μL Opti-MEM培养基稀释后轻轻混匀，将B液加入A液轻轻混匀，室温静置10~15 min后逐滴加入6孔板中，放至培养箱用于后续试验。

1.2.4　RT-qPCR

提取各肺组织和细胞样品总RNA，反转录合成cDNA。反应体系和程序：1 μg RNA、 4 μL 4×gDNA wiper Mix、ddH₂O补至16 μL混匀，42 ℃ 2 min；在上一步液体中加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix 混匀37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。利用表1引物进行RT-qPCR试验，反应体系：模板cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ddH₂O补至20 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。组内设3个重复孔，采用2^-ΔΔCt解析法进行分析。

1.2.5　Western blot

分别提取羊肺组织及细胞的总蛋白和线粒体蛋白，采用Western blot检测各蛋白相对表达水平，一抗分别为β-actin（1∶20 000）、DRP1（1∶1 000）、p-DRP1（Ser616）（1∶1 000）、MFF（1∶5 000）、MFN2（1∶5 000）、OPA1（1∶1 000）、His（1∶1 000）、VDAC1（1∶5 000），二抗分别为HRP标记的山羊抗兔（1∶5 000）和山羊抗鼠（1∶5 000）。

1.2.6　免疫荧光共定位

将细胞接种在激光共聚焦小皿中，待贴壁稳定后用4%多聚甲醛固定20 min；0.5% Triton X-100通透15 min；5% BSA 37 ℃封闭30 min；结束后一抗TOMM20（1∶200）、p-DRP1（Ser616）（1∶50）4 ℃过夜孵育；用含荧光标记的二抗（Alexa Fluor 488偶联的抗兔IgG，1∶100；Alexa Fluor 647偶联的抗兔IgG，1∶100）37 ℃孵育1 h；DAPI孵育10 min，置于激光共聚焦显微镜下观察。

1.3　统计学分析

每组试验重复3次，试验数据以平均值±标准误（Mean±SE）表示。数据采用GraphPad Prism9.0软件处理，2组均数间用t检验，2组以上均数比较用双因素方差分析（Two-way ANOVA）进行显著性分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2　结果与分析

2.1　绵羊肺组织中线粒体动力学相关因子的检测

2.1.1　绵羊肺组织中线粒体动力学相关因子mRNA相对表达水平检测

线粒体分裂因子DRP1、MFF和线粒体融合因子MFN2、OPA1 的mRNA相对表达水平检测结果如图1所示，与健康组相比，自然感染JSRV病肺组织中线粒体分裂因子DRP1（P<0.001）和MFF（P<0.01）相对表达水平均显著上调；线粒体融合因子MFN2和OPA1相对表达水平均显著下调（P<0.01）。

2.1.2　绵羊肺组织中线粒体动力学相关因子蛋白相对表达水平检测

线粒体分裂蛋白DRP1、p-DRP1（Ser616）、MFF和线粒体融合蛋白MFN2、OPA1蛋白相对表达水平的检测结果如图2所示，与健康组相比，自然感染JSRV病肺组织中线粒体分裂蛋白DRP1（P<0.001）、p-DRP1（Ser616）（P<0.001）和MFF（P<0.05）相对表达水平均显著上调；线粒体融合蛋白MFN2和OPA1相对表达水平显著下调（P<0.05）。综上，自然感染JSRV病肺组织中存在线粒体分裂水平上调，融合水平下调的线粒体动力学紊乱现象。

2.2　JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中线粒体动力学相关因子的检测

2.2.1　JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中线粒体动力学相关因子mRNA相对表达水平检测

分别在24、48和72 h时收集细胞样品，检测JSRV env及线粒体分裂因子DRP1、MFF和线粒体融合因子MFN2、OPA1的mRNA水平，如图3所示，JSRV-env组中JSRV env在24、48和72 h时显著高于Blank组和Negative control组，且在48 h后表达量趋于稳定。相较于Blank组和Negative control组，JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体分裂因子DRP1和MFF的mRNA相对表达水平在24、48和72 h时均显著上调（P<0.001）；线粒体融合因子OPA1和MFN2 mRNA相对表达水平在24、48和72 h时均显著下调（P<0.01）。

2.2.2　JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中线粒体动力学相关因子蛋白相对表达水平检测

分别在24、48和72 h时收集细胞样品检测线粒体分裂蛋白DRP1、p-DRP1（Ser616）、MFF和线粒体融合蛋白MFN2、OPA1的蛋白相对表达水平，如图4所示，相较于Blank组和Negative control组，JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体分裂蛋白DRP1、p-DRP1（Ser616）和MFF蛋白相对表达水平在24、48和72 h时均显著上调（P<0.01），线粒体融合蛋白OPA1（P<0.05）和MFN2（P<0.05）蛋白相对表达水平均显著下调。综上，线粒体分裂因子DRP1、p-DRP1（Ser616）和MFF在JSRV Env转化BEAS-2B细胞中呈高表达水平，说明线粒体分裂水平上调，线粒体融合因子OPA1和MFN2在JSRV Env转化BEAS-2B细胞中呈低表达水平，说明线粒体融合水平下调，同自然感染JSRV病肺组织中结果一致，提示JSRV作用下线粒体发生动力学紊乱现象。

2.3　JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中线粒体分布

为了进一步探究JSRV Env转化BEAS-2B细胞后对线粒体分裂和融合的影响，利用激光共聚焦显微镜观察了BEAS-2B细胞的线粒体分布情况，如图5所示，JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体网络结构被破坏，线粒体结构异常，呈碎片化、颗粒状或点状，而Blank组和Negative control组线粒体网络结构完整，线粒体细长表现为管状。综上，JSRV Env转化BEAS-2B细胞后诱导了线粒体分裂，进而导致线粒体呈现碎片化。

2.4　JSRV Env 转化BEAS-2B细胞中DRP1磷酸化及其向线粒体移位的检测

DRP1在线粒体分裂过程中起着核心作用，其主要位于细胞质中，一旦被招募到线粒体并在Ser616位点发生磷酸化，就会启动分裂过程。为了探究JSRV Env转化BEAS-2B细胞后是否通过促进DRP1 Ser616位点磷酸化及其随后移位到线粒体来诱导线粒体分裂，利用激光共聚焦显微镜观察JSRV Env转化BEAS-2B细胞中p-DRP1（Ser616）与线粒体共定位情况，如图6所示，相较于Blank组和Negative control组，JSRV Env转化BEAS-2B细胞中DRP1 Ser616位点的磷酸化水平显著增强，同时，还观察到p-DRP1（Ser616）在线粒体中的共定位荧光斑点增加，表明JSRV Env转化BEAS-2B细胞后通过刺激Ser616位点磷酸化促进DRP1向线粒体移位。

为进一步证实这一现象，检测了线粒体和胞质亚组分蛋白中DRP1和p-DRP1（Ser616）蛋白相对表达水平，结果如图7所示，JSRV Env转化BEAS-2B细胞后显著上调了线粒体蛋白中p-DRP1（Ser616）磷酸化水平（P<0.001）。综上所述，JSRV Env转化BEAS-2B细胞后通过促进DRP1 Ser616位点磷酸化及其移位到线粒体来诱导线粒体分裂。

3　讨 论

越来越多的研究表明，线粒体分裂关键因子DRP1和MFF以及线粒体融合关键因子OPA1和MFN2介导的线粒体动力学与病毒感染和肿瘤的发生发展息息相关。线粒体动力学失衡是多种病毒和肿瘤的关键致病机制之一，病毒可以直接或间接靶向线粒体分裂关键因子DRP1和MFF以及线粒体融合关键因子OPA1和MFN2，破坏线粒体动力学的平衡，导致线粒体功能障碍，从而发展出促进自身感染的策略。

本研究发现自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞中线粒体分裂蛋白DRP1、p-DRP1（Ser616）和MFF相对表达水平均上调，线粒体融合相关蛋白OPA1和MFN2相对表达水平均下调，提示自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞中均发生了线粒体分裂水平上调，融合水平下调的动力学紊乱现象。Diranian等^［17］研究发现寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染人类视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）的模型中线粒体分裂蛋白DRP1和p-DRP1（Ser616）表达水平上调，线粒体融合蛋白MFN2和OPA1的表达水平下调，最终导致线粒体网络结构断裂形成碎片化，而使用药物抑制DRP1活性后，病毒复制水平显著降低。Li等^［18］研究发现牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染后线粒体分裂蛋白DRP1被激活，其蛋白表达水平显著上调，而线粒体融合蛋白MFN2表达水平下调，使线粒体发生倾向于分裂的线粒体动力学紊乱现象，从而促进病毒复制以推动病毒感染进程。除了病毒以外，线粒体动力学与肿瘤发生发展也密切相关。Rehman等^［19］发现，在人肺癌体内和体外试验中均发现线粒体分裂蛋白DRP1表达水平上调，线粒体融合蛋白MFN2蛋白表达水平下调，而过表达MFN2或抑制DRP1已被发现能减缓肿瘤细胞的生长并促进细胞凋亡，表明人在肺癌中通过调控线粒体分裂和融合水平从而达到调控肿瘤细胞发生发展的目的。此外，Wu等^［20］研究发现人肝癌中线粒体分裂相关蛋白DRP1表达水平上调，线粒体融合相关蛋白MFN1表达水平下调，最终促进癌细胞迁移、侵袭以及驱动肿瘤生长。以上结果均与本研究结果一致，提示线粒体动力学可能在JSRV致病机制中发挥一定作用，JSRV感染可能通过使线粒体发生倾向于分裂的线粒体动力学紊乱从而达到促进疾病发展的目的。

DRP1作为调控线粒体分裂的关键作用因子，在调节线粒体动力学中起着主要作用。DRP1的易位和功能取决于翻译后磷酸化的调控，Ser616和Ser637是DRP1中的2个重要的磷酸化位点，也是许多病毒调控线粒体分裂活性的靶标^［10］。其中Ser637位点磷酸化抑制线粒体分裂，而Ser616位点磷酸化激活诱导的线粒体分裂可能是启动线粒体自噬的前提^［21］。本研究发现JSRV Env转化BEAS-2B细胞后线粒体蛋白中p-DRP1（Ser616）磷酸化水平显著上调，且p-DRP1（Ser616）与线粒体的共定位荧光斑点增加。Lee等^［15］研究发现HCV感染通过刺激DRP1 Ser616位点磷酸化，促进线粒体分裂蛋白DRP1和MFF表达，进而促进DRP1募集到线粒体，导致线粒体分裂水平上调，从而诱导PINK-Parkin通路介导的线粒体自噬。同样，Kim等^［22］研究发现乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）诱导线粒体核周聚集，并通过刺激DRP1 Ser616位点的磷酸化触发DRP1向线粒体移位，导致线粒体分裂，进而诱导PINK-Parkin通路介导的线粒体自噬。以上结果与本研究前期结果一致，即JSRV Env转化BEAS-2B细胞后通过刺激DRP1 Ser616位点磷酸化及其移位到线粒体来诱导线粒体分裂。值得注意的是，在人非小细胞肺癌细胞（A549）相关研究中发现DRP1缺失，线粒体分裂减少使线粒体自噬水平受阻，最终导致细胞凋亡减少；而过表达DRP1后A549细胞中线粒体自噬得到恢复^［23-24］。本课题组前期研究发现自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B中均存在PINK-Parkin通路介导的线粒体自噬现象，推测DRP1介导的线粒体分裂可能在JSRV诱导的线粒体自噬中扮演重要角色，后续本研究将在JSRV作用下分别过表达和使用Mdivi-1抑制DRP1后进一步探究其介导的线粒体分裂在线粒体自噬中发挥的作用及对JSRV Env蛋白复制的影响。

本研究在自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞中均发现线粒体分裂水平上调，融合水平下调的现象，且线粒体分裂水平上调是通过DRP1 Ser616位点磷酸化及其移位到线粒体诱导，提示JSRV作用下的线粒体动力学紊乱。这些发现表明线粒体动力学可能在JSRV感染中扮演复杂的角色，同时也为JSRV致病机制的研究提供了新的方向。

4　结 论

本研究发现自然感染JSRV羊肺组织和JSRV Env转化BEAS-2B细胞中均存在线粒体分裂水平上调，融合水平下调的线粒体动力学紊乱现象。该发现为阐释JSRV的致病机制提供了新的细胞生物学视角。初步迹象表明，此现象与细胞生长异常相关联，未来研究可通过干预此过程进一步验证其在肺腺瘤发生中的具体角色，为开发针对该疫病的新型防控策略提供理论基础。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32360863)

内蒙古自治区科技计划项目(2025KYPT0126)

内蒙古自治区科技计划项目(2025KYPT0127)

教育厅团队项目“兽医基础与牛羊疫病防控技术研发创新团队”(NMGIRT2412)

高校基本科研业务费项目“牛羊疫病防控与发育工程创新团队资助项目”(BR22-13-08)