基于机器学习与逆向网络药理学的牛呼吸道疾病核心基因筛选及中药组分预测

Screening of core genes and prediction of traditional Chinese medicine components for bovine respiratory disease based on machine learning and reverse network pharmacology

摘要

为探索牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease， BRD）防治新策略，本研究整合生物信息学、机器学习与网络药理学等多组学分析方法，初步探索并分析了BRD的分子调控网络及潜在中药干预靶点。结果表明：1）从基因表达综合（Gene expression omnibus， GEO）数据库获取GSE162156数据集后通过差异表达分析鉴定出1 124个差异表达基因，结合GeneCards数据库筛选的1 275个BRD相关基因，经韦恩图取交集，最终获得124个BRD相关差异表达基因，GO功能富集分析显示这些基因显著富集于炎症反应、免疫应答等生物学过程，KEGG通路分析表明其主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用等与免疫炎症密切相关的信号通路。2）基于STRING数据库构建蛋白质互作网络，结合LASSO回归、随机森林与支持向量机-递归特征消除3种机器学习算法进行核心基因筛选，最终确定IL2RA、HP、NCF1和ELN 4个基因为BRD的核心调控基因。3）通过miRNet数据库对核心基因进行上游miRNA调控分析，发现IL2RA和NCF1分别受到多个特异性miRNA的靶向调控，提示转录后调控机制在BRD发病过程中可能发挥重要作用。4）基于逆向网络药理学方法针对4个核心基因在中药系统药理学数据库分析平台（Traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform， TCMSP）中检索其关联的活性成分，发现NCF1与异鼠李素和槲皮素密切关联，进一步反向匹配得到194种潜在关联中药，其中35种中药同时含有这2种活性成分。本研究通过多组学整合分析阐释了BRD的分子调控机制，识别了核心基因及潜在中药干预靶点，为BRD的发病机制研究提供了新的分子视角，也为后续靶向药物研发与中药防治策略的制定提供了理论基础。

Abstract

To explore new strategies for the prevention and treatment of bovine respiratory disease （BRD）， this study integrated multi-omics analytical approaches， including bioinformatics， machine learning and network pharmacology to preliminarily explore and analyze the molecular regulatory network of BRD as well as its potential targets for traditional Chinese medicine intervention. The results showed that：1） After obtaining the GSE162156 dataset from the gene expression omnibus （GEO） database， 1 124 differentially expressed genes through differential expression analysis were identified. Combining with 1 275 BRD-related genes filtered from the GeneCards database， 124 BRD-related differentially expressed genes were obtained by intersection analysis using a Venn diagram， GO functional enrichment analysis showed that these genes were significantly enriched in biological processes such as inflammatory response， and immune response. KEGG pathway analysis indicated that they mainly participate in signaling pathways closely related to immune inflammation， such as cytokine-cytokine receptor interaction. 2） A protein-protein interaction network was constructed based on the STRING database， and core gene selection was performed using three machine learning algorithms： LASSO regression， random forest， and support vector machine-recursive feature elimination， ultimately identifying IL2RA， HP， NCF1， and ELN as four regulatory nodes in BRD. 3） Upstream miRNA regulatory analysis of core genes was conducted using the miRNet database， revealing that IL2RA and NCF1 were targeted by multiple specific miRNAs， suggesting that post-transcriptional regulatory mechanisms may play an important role in the pathogenesis of BRD. 4） Based on reverse network pharmacology， the associated active components of four core genes from the traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform （TCMSP） database were retried. It was found that NCF1 was closely associated with isorhamnetin and quercetin， leading to the identification of 194 potential associated traditional Chinese medicines （TCMs）， among which 35 TCMs contain both active components. This research elucidated the molecular regulatory mechanisms of BRD through multi-omics integration analysis， identifying core genes and potential TCM intervention targets. It provides a new molecular perspective for the study of the pathogenesis of BRD and lays a theoretical and experimental foundation for subsequent targeted drug development and the formulation of TCM prevention and treatment strategies.

Graphical abstract

关键词

牛呼吸道疾病 / 逆向网络药理学 / 差异表达基因 / 机器学习 / 中药组分预测

Key words

bovine respiratory disease / reverse network pharmacology / differentially expressed genes / machine learning / prediction of traditional Chinese medicine components

牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease， BRD）是集约化牧场中常见的疾病之一，其发病因素包括应激、环境变化及病原体感染等。主要临床表现为咳嗽、流涕、呼吸困难和发热，严重时可导致犊牛生长迟缓、生产力下降，甚至死亡。BRD的病原体主要包括病毒（如牛传染性鼻气管炎病毒、呼吸道合胞体病毒等）、细菌（如曼氏杆菌、巴氏杆菌等）以及支原体等^［1-2］。近年来，国内养牛业发展迅速，规模化与集约化程度不断提高，但BRD问题日益突出，严重制约我国牛产业的健康发展。目前，BRD的防治手段主要依赖抗生素，但长期使用易导致耐药性和药物残留超标等问题。

RNA 测序（RNA sequencing， RNA-Seq）是用于分析基因表达谱、探究功能机制和分子过程的常用技术。多项 RNA-Seq 研究已成功鉴定出 BRD 发病机制中涉及的关键基因和宿主分子机制。Scott等^［3］通过分析入场肉牛的全血转录组，发现具有BRD自然抵抗力的牛只在入场时ALOX15和HPGD等基因表达上调，这些基因参与抗炎脂质介质合成和血管紧张素原代谢过程。后续他们采用LASSO回归和随机森林等机器学习方法，建立了能有效区分健康与患病牛的模型，并鉴定出CFB等与临床症状显著相关的潜在生物标志物^［4-5］。Ghahramani等^［6］运用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis， WGCNA）发现，BRD相关基因模块显著富集于沙门氏菌感染、NOD样受体信号通路、坏死性凋亡和Toll样受体信号通路等免疫相关途径。Jiminez等^［7］的全血转录组测序研究表明，BRD病牛血液中抗菌肽基因（如CATHL2、CATHL6）和急性期蛋白基因（如HP、S100A8/A9）表达显著升高，而血红蛋白合成相关基因（如HBA1、HBA2）表达下调，表明系统性免疫炎症和代谢重编程被激活。Sheng等^［8］最新研究利用LASSO与随机森林算法，筛选出ADGRG3、CDKN1A、CA4、GGT5和SLC26A8 5个基因作为BRD的潜在诊断标志物。这些研究为BRD的调控网络提供了宝贵见解。尽管上述研究在识别BRD关键基因及诊断模型构建方面取得了重要进展，但其分析多集中于差异表达基因的筛选与下游功能注释，对基因表达的上游调控机制（如miRNA介导的转录后调控）探索不足。同时，现有工作尚未能基于所识别的分子靶点系统预测具有干预潜力的中药活性成分，从而未能有效衔接机制解析与治疗策略开发。

为弥补上述研究空白，本研究整合生物信息学、机器学习与网络药理学方法，在筛选BRD相关核心基因的基础上，进一步构建其上游miRNA调控网络，并预测能作用于核心基因的潜在中药活性成分，为开发靶向性的中药防治策略提供新的理论依据。

1　材料与方法

1.1　数据的获取

在基因表达综合（Gene expression omnibus， GEO.https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库^［9］中下载GSE162156数据集的表达谱数据。该数据集包含25例 BRD样本和18例非牛呼吸道疾病（non-BRD）样本，样本类型为肉牛全血，经GPL23295平台进行RNA测序，获得基因表达谱。利用Ensembl数据库（https：//www.ensembl.org）将Ensembl id转换为基因名称，使用R语言中的“limma”包对数据进行差异分析^［10］，筛选标准设定为|log₂FC|>1且校正后P值（adj.P.Val）<0.05，以识别差异表达基因（Differentially expressed genes， DEGs）。同时，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中，以“bovine respiratory disease”为关键词检索与BRD相关的基因，并筛选出关联分数（Relevance score）≥20的基因。利用Venny 2.1工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）对上述2个基因集取交集，并绘制韦恩图，所得交集基因即为与牛呼吸道疾病相关的差异表达基因（BRD-related DEGs）。

1.2　GO和KEGG功能富集分析

基于BRD相关的差异表达基因，利用R语言的“clusterProfiler”、“biomaRt”及“org.Bt.eg.db”软件包进行了基因本体（Gene ontology， GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析^［11-13］。

1.3　蛋白质相互作用网络构建

将BRD相关差异表达基因输入STRING平台（https：//cn.string-db.org/）进行蛋白质相互作用（Protein-protein interaction， PPI）网络分析^［14］，物种选择“Bos taurus”且相互作用置信度阈值设定为≥0.7，随后将获得的网络数据导入Cytoscape 3.6.0版本软件进行可视化^［15-16］，基于网络拓扑分析中常用的策略，选取Degree排名前30位的基因作为候选基因用于后续分析。

1.4　机器学习算法筛选BRD核心基因

基于上述获得的30个候选基因，采用LASSO回归、随机森林（Random forest， RF）、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）3种机器学习算法联合筛选BRD相关核心基因。其中LASSO回归借助R语言“glmnet”包，通过10折交叉验证确定最优惩罚系数，筛选非零回归系数对应的特征基因；RF算法利用“randomForest”包构建含500棵决策树的分类模型，并依据基尼指数（MeanDecreaseGini）评估基因重要性，选取排名前15的基因；SVM-RFE通过“caret”和“kernlab”包以递归特征消除方式并以交叉验证均方根误差最小化为标准确定最优特征基因。上述算法中的关键参数（如交叉验证折数、决策树数量等）均采用对应R语言包的默认设置，以增强方法的可重复性与通用性，最终取3种方法所得基因的交集作为BRD核心基因。

1.5　核心基因的miRNA调控

借助miRNet数据库（https：//www.mirnet.ca/miRNet/）^［17］在线分析平台，针对筛选得到的核心基因展开上游调控miRNA的预测分析，在未设定额外阈值参数的情况下，获取了平台默认推荐的所有预测miRNA结果。

1.6　逆向收集潜在中药

将核心靶点的基因名称输入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）^［18］，获取其对应的蛋白质信息。基于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP.http：//tcmspw.com/tcmsp.php）^［19］，以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18为筛选标准，筛选潜在活性成分，并逆向收集其对应中药。

2　结果与分析

2.1　牛呼吸道疾病靶点库的建立

通过对GEO数据集GSE162156的差异表达分析，共获得1 124个DEGs（图1（a））；结合GeneCards数据库中筛选出的1 275个BRD相关基因，经韦恩图取交集后最终确定124个BRD相关差异表达基因（图1 （b））。

2.2　GO和KEGG功能富集分析

对筛选得到的124个BRD相关差异基因进行功能富集分析，以推测其潜在生物学功能。GO分析显示，在生物学过程方面，这些基因显著富集于“炎症反应”“对外部生物刺激的响应”等过程；细胞组分主要富集于“细胞表面”“膜的一侧”等位置；分子功能则主要富集在“受体配体活性”“信号因子激活剂活性”等方面，提示这些差异基因可能在免疫识别与信号启动中发挥重要作用（图2（a））。KEGG通路分析进一步表明，这些基因在“细胞因子-细胞因子受体相互作用”“结核病”等与感染和免疫密切相关的通路中显著富集（图2（b））。上述结果从不同层面揭示，BRD的发病机制可能与宿主固有免疫及炎症反应的过度或异常激活密切相关。该发现为在分子水平深入解析BRD的发病机制，并针对特定通路探寻潜在治疗靶点提供了线索。

2.3　BRD相关差异表达基因的PPI网络构建

将124个BRD相关差异表达基因上传至STRING数据库进行分析。在数据处理过程中，去除网络中未连接的基因节点，成功获得PPI网络图（图3），进一步利用Cytoscape软件对网络进行拓扑学分析，计算各节点的节点度与介数中心性，排名前30的如表1所示，IL10、TLR4与CCL2等基因在节点度与介数中心性上均表现突出（表1），处于网络核心位置，提示其可能为关键枢纽靶点。

2.4　BRD核心基因的鉴定

PPI网络中度值排名前30的基因，进一步通过LASSO回归、RF和SVM-RFE 3种机器学习算法联合筛选BRD相关核心基因。如图4（a）所示，LASSO回归筛选出9个基因，RF筛选出15个基因，SVM-RFE筛选出9个基因，最终得到4个交集基因（IL2RA、HP、NCF1和ELN），该交集基因被确定为BRD的核心基因。这4个基因的表达水平在BRD样本中均显著高于对照样本（图4（b））。值得注意的是，PPI网络中具有高连接度的基因（如IL10、TLR4、CCL2）并未被后续机器学习算法选中，这反映了2种方法筛选逻辑的差异：PPI分析旨在识别生物网络中的潜在枢纽基因，侧重于生物学重要性；而机器学习算法以优化分类性能为目标，筛选的是在特定数据集中最具区分度的表达特征。因此，高连接度基因虽然可能在通路调控中扮演关键角色，但其表达模式对当前数据集的分类贡献有限。这一结果提示，网络枢纽基因与高效分类标志物可互为补充，共同深化对BRD机制的理解。

2.5　核心基因的miRNA调控分析

基于IL2RA、HP、NCF1、ELN 4个核心基因利用miRNet数据库开展上游miRNA调控分析，结果显示只有IL2RA和NCF1 2个基因受到多个特异性miRNA调控，而HP和ELN 2个基因未发现调控关系。其中IL2RA受bta-miR-140、bta-miR-1301、bta-miR-2324、bta-miR-2394、bta-miR-1584-3p、bta-miR-2442、bta-miR-2326及bta-miR-2454-5p共8个miRNA靶向调控（图5（a）），NCF1则受bta-miR-744、bta-miR-2305、bta-miR-1777b、bta-miR-2881、bta-miR-8550及bta-miR-320b共6个miRNA靶向调控（图5（b）），调控网络呈现单个核心基因受多个miRNA共同调控的“一对多”的特征，提示BRD相关核心基因的表达可能受复杂且精确的转录后调控网络影响，细胞可通过微调不同miRNA的表达水平实现对靶基因表达的精准动态调控，这种冗余性还能在个别miRNA表达波动时维持靶基因表达相对稳定，保障相关生物学功能正常运行。

2.6　核心基因关联活性成分及中药的逆向筛选

基于核心基因在中药调控层面的逆向分析，通过网络药理学方法从TCMSP数据库筛选出满足OB≥30%与DL≥0.18标准的高关联活性成分，结果发现，核心基因NCF1与2个符合筛选标准的活性成分（异鼠李素和槲皮素）密切相关。进一步逆向匹配其来源中药，共得到194种潜在关联中药。其中，35种中药同时含有异鼠李素和槲皮素这2种活性成分（表2）。

3　讨 论

本研究通过GEO数据库获取基因差异表达基因并结合GeneCards数据库筛选，共获得124个BRD相关差异表达基因，GO与KEGG富集分析显示这些基因显著富集于炎症反应、细胞因子-细胞因子受体相互作用、感染性疾病等重要通路，提示BRD发病与宿主免疫炎症反应紊乱密切相关，PPI网络分析筛选出IL10、TLR4与CCL2等核心靶点，这些靶点在网络中连接度较高，提示可能在调控BRD中发挥关键作用。选取度值前30的基因经LASSO回归、RF、SVM-RFE3种机器学习算法交叉验证，识别出可能在BRD发生发展中发挥关键作用的IL2RA、HP、NCF1和ELN 4个核心基因。这4个基因在BRD的发病过程中可能协同发挥作用。IL2RA（编码IL-2受体α链）的表达异常，可能通过干扰T细胞的活化与调节性T细胞的功能，导致免疫应答失衡，从而与BRD病程中的免疫抑制状态相关；HP（结合珠蛋白）作为急性期反应蛋白，不仅可通过结合游离血红蛋白以减轻氧化损伤、限制病原体铁利用而发挥间接抗菌作用，其表达水平的动态变化也可能直接反映BRD感染的炎症严重程度与机体应激状态；NCF1作为NADPH氧化酶复合体的关键调控亚基，其功能正常是中性粒细胞呼吸爆发及活性氧依赖的胞内杀菌作用所必需的，该基因的功能缺陷可能直接削弱宿主对细菌性病原体的清除能力，导致感染迁延；ELN（弹性蛋白）是维持肺组织弹性的关键细胞外基质成分，在BRD相关的炎症与损伤过程中，其表达的失调可能影响肺泡结构的修复与重塑，并与肺纤维化等慢性病理改变密切相关。综上，这4个基因分别从免疫调节（IL2RA）、炎症与应激调控（HP）、氧化杀菌（NCF1）及组织修复（ELN）4个层面，构成了一个相互关联的调控网络，共同参与BRD的发生与发展。对比Sheng等^［8］研究中筛选出的、侧重作为血液诊断标志物的ADGRG3（调控粒细胞迁移与激活）和CDKN1A（响应病毒感染与DNA损伤，调控细胞周期）等基因，本研究所揭示的基因网络具有重要的区分和补充价值。Sheng等^［8］的研究侧重于寻找早期诊断的标志物，而本研究筛选的基因则更深入地揭示了BRD从免疫失衡、氧化应激、杀菌缺陷到组织结构重塑的完整病理生理学过程。

对4个核心基因进行上游miRNA调控分析发现IL2RA和NCF1与多个特异性miRNA存在靶向关系，提示BRD发生可能涉及转录后调控机制，其中预测靶向IL2RA的miR-140，其同源物miR-140-5p已被研究证实是一个关键的炎症负调控因子^［20］。该研究表明，miR-140-5p可通过直接靶向TLR4并抑制下游MyD88/NF-κB信号通路，显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的表达，从而在炎症模型中发挥保护作用。这提示，bta-miR-140可能通过类似机制参与调控BRD相关的过度炎症反应。

针对4个核心基因，利用TCMSP数据库进行逆向网络药理学分析发现核心基因NCF1与甘草、银杏叶、山豆根等中药的活性成分（异鼠李素和槲皮素）存在密切关联，异鼠李素与槲皮素均为具有广泛药理活性的天然黄酮类化合物。研究表明，它们对呼吸系统疾病具有明确的改善作用：异鼠李素可通过激活Nrf2/HO-1抗氧化通路和抑制细胞凋亡与MAPK炎症通路，显著减轻甲型流感病毒性肺炎的病理损伤^［21］；而槲皮素则可通过抗氧化、抗炎、调节细胞凋亡与自噬、改善气道重构及抗感染等多种机制，在慢性阻塞性肺疾病的治疗中发挥多靶点保护作用^［22］。基于上述证据，提示异鼠李素与槲皮素可能通过调节与BRD相关的氧化应激、免疫炎症等关键病理过程，在BRD的防治中具有重要应用价值。然而，本研究在成分筛选阶段主要参考了TCMSP数据库中基于人类药代动力学参数（如OB≥30%和DL≥0.18）的推荐标准。需要指出的是，将这些标准直接应用于筛选兽用或防治牛病的中药活性成分，其合理性值得深入探讨。中药成分的体内过程复杂，物种差异显著，许多在动物体内有效的成分其OB值可能低于现行人类标准，而某些高OB值的成分在反刍动物复杂的消化生理环境下其实际生物利用度也可能发生显著变化。因此，未来的研究需建立或参考更契合反刍动物生理特点的药代动力学筛选标准，并对预测出的活性成分进行试验验证，以更准确地评估其实际应用潜力。

4　结 论

本研究整合生物信息学、机器学习与网络药理学等方法，鉴定出IL2RA、HP、NCF1和ELN 4个核心基因，通过上游调控分析发现核心基因与多个miRNA存在靶向关系，网络药理学分析表明NCF1与甘草、银杏叶等中药活性成分（异鼠李素和槲皮素）密切相关，这些发现既为BRD发病机制研究提供了新的分子视角，也为后续靶向药物研发与中药防治策略制定提供了重要的理论依据。尽管这些研究结果提示药物与基因存在关联，但由于中药在实际临床应用中用药原则难以通过试验分析，所以本研究中核心基因在BRD中的表达谱、预测的miRNA与核心基因之间的调控关系，以及研究所发现的中药活性成分（如异鼠李素、槲皮素）治疗BRD的药效学价值均未获得验证。下一步工作将致力于通过湿试验验证上述预测结果，并深入探索中药复方配伍在调节相关通路中的整体效应。

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基金资助

国家自然科学基金项目(62262050)