基于BSA-Seq的粒用高粱叶面积QTL定位

QTL mapping for leaf area in grain sorghum based on BSA-Seq

摘要

为定位调控高粱不同叶位叶面积的关键基因位点，以‘01-26B’和‘7009B’2个核心亲本系构建了F₂群体，测定F₂植株的旗叶、第2、第3和第4叶的叶面积，并以此分别构建4个叶位的大叶和小叶家系极端混池进行集群分析法（BSA）测序，定位关键SNP位点，并发掘关键基因。结果表明：F₂群体叶面积为典型的数量性状，且不同叶位的叶面积呈极显著的正相关，BSA测序发现10个样本的测序数据量充足，测序深度在15.38~23.05×，错误率在0.024 9%~0.026 9%，可满足后续定位要求。在全基因组范围内分别筛选不同叶位叶面积相关位点，分别发现17、31、9和16个共73个相关SNP位点，根据注释结果共得到15个位于基因功能区的SNP位点，其中有8个SNP位点位于基因外显子上，6个造成非同义突变，2个位于基因5’UTR区域，1个位于基因3’UTR区域，4个位点位于基因上游区域。1号染色体58 490 747 bp处的碱基发生由T到G的突变，该位点在4个叶位叶面积定位中均被检测到，确定是“一因多效”位点。综上，应用2个核心亲本系构建了F₂群体，在此基础上通过构建极端混池并采用BSA-seq技术，成功定位到高粱叶面积相关的73个SNP位点，并鉴定出1个关键的“一因多效”位点。

Abstract

To identify the key gene loci regulating the leaf area at different leaf positions in sorghum， an F₂ population was constructed from two core inbred parental lines‘01-26B’and‘7009B’. The leaf area of the flag leaf， 2^nd leaf， 3^rd leaf， and 4^th leaf were measured， respectively. Based on this， extreme mixed pools of large-leaf and small-leaf families from four leaf positions were constructed for bulked segregation analysis（BSA） sequencing to map key SNP loci and mine the key genes. The results are as follows： The leaf area in the F₂ population exhibited a typical quantitative trait pattern， and it showed extremely significant positive correlations among leaves of different leaf positions. BSA sequencing found that the volume of the 10 samples was sufficient， with sequencing depths between 15.38 - 23.05 × and error rates between 0.024 9% - 0.026 9%， meeting the requirements for subsequent mapping. Genome-wide screening for leaf area-related loci of different positions identified 73 SNP loci including 17， 31， 9， and 16. According to annotation results， 15 of these SNP loci were located in gene functional regions， including 8 in exons， 6 causing nonsynonymous mutations， 2 in the 5’ UTR， 1 in the 3’ UTR， and 4 in upstream regions. Notably， a T-to-G variation at the physical position of 58 490 747 bp on chromosome 1 was detected in the mapping of leaf areas across all four different leaf positions， suggesting a pleiotropic locus. In summary， this study successfully identified 73 SNP loci associated with leaf area in sorghum and pinpointed one key pleiotropic locus， through applying BSA-seq technology by constructing an F₂ population with two core inbred parental lines.

Graphical abstract

关键词

高粱 / 叶面积 / BSA-Qeq / SNP位点

Key words

sorghum / leaf area / BSA-Seq / SNP loci

高粱是世界第五大粮食作物，是典型的C₄作物，产量受群体的截光能力的直接影响^［1］。密植可以提高群体产量，叶型是影响种植密度的主要因素之一^［2］。玉米增产的主要原因是耐密植品种的选育和推广^［3］。但是高粱植株一般叶片较多且肥大而平展、空间分布不合理，在密植的情况下会造成冠层内遮荫，邻近植株竞争水分、养分和光等限制性资源的问题；另外，较多的叶片也不利于机械化收获^［4］。为应对上述问题，自理想株型概念提出以来育种方向逐渐转向群体表型，注重基因型与环境的互作，以优化植株形态并协同改良产量性状^［5-7］。理想株型通常应具备矮秆、叶片分布均匀且向上展开、穗大而直立等特征，旨在通过调节个体结构与空间构成，实现群体光合效率与有机物合成的动态平衡^［6-7］。叶片的直立性是理想株型的重要特点，上层叶片直立有利于光透射到群体内部，使中下层叶片均匀受光，从而改善了群体内部的生态环境^［7-10］。叶片的直立性与叶面积、叶厚有关，叶面积过大或过薄均不利于向上展开^［11-12］。适度缩小旗叶面积以增强直立性，同时使下方叶片面积渐增、形成“塔型”结构，有助于更高效地利用光能^［13-15］。因此，开展高粱核心亲本系中控制叶面积基因的遗传机制研究，对培育耐密高产适应机械化生产的高粱品种具有重要价值。

在作物叶形性状的遗传解析方面，玉米和水稻等主要作物已取得显著进展。玉米中通过大规模群体鉴定筛选出212个控制叶型变异的QTL，其中多数为群体特异性位点，揭示了遗传变异的广泛性和稀有功能位点的普遍性^［16］。通过Meta-QTL分析，研究者进一步整合出22个叶长、22个叶宽、12个叶面积和17个叶夹角的一致性QTL，并筛选出44个与叶片发育相关的候选基因^［17］。水稻中有关研究更为深入，如窄叶突变体nal21的鉴定显示，NAL21基因编码核糖体小亚基蛋白RPS3A，其突变会导致生长素响应因子翻译效率降低，从而影响叶片细胞分裂和扩展^［18］。这些研究为作物叶部性状的遗传改良提供了重要靶标。在高粱叶形性状研究方面，近年来取得了重要突破。通过全基因组关联分析，在高粱多样性群体中鉴定出19个叶宽QTL，这些位点与玉米和水稻的叶宽QTL高度对应，表明禾本科作物叶宽遗传调控的保守性^［19］。此外，Zou等^［20］利用超高通量SNP标记构建的遗传图谱，在高粱重组自交系群体中分别检测到1个旗叶叶长和6个叶宽QTL，但贡献率普遍较低，均在10%以下。

近年来随着高通量DNA序列分析技术的发展和新测序平台的应用，将集群分析法（bulked segregation analysis，BSA）和高通量测序相结合的BSA-Seq方法能够快速、准确地获得目标性状所关联的基因在染色体上的位置，便于基因高效定位^［21］。BSA-Seq方法已经被广泛应用到水稻^［22-23］、小麦^［24-25］、玉米^［26-27］等作物的遗传研究中，获得了大量可靠的QTL。目前，高粱叶形相关基因定位多集中在叶长和叶宽等单独性状，鲜有对叶面积定位的研究报道。本研究以‘01-26B’和‘7009B’2个核心亲本系为亲本构建了F₂代群体，测定旗叶、第2、第3和第4叶的叶面积，分别构建4个叶位的大叶和小叶家系极端混池进行BSA测序，定位关键SNP位点，发掘关键基因，旨在定位调控高粱不同叶位叶面积的关键基因位点，以期为培育耐密高产适应机械化生产的高粱品种提供参考。

1　材料与方法

1.1　供试材料

供试材料为高粱保持系‘01-26B’和‘7009B’以及以二者为亲本构建的包含217个家系的F₂群体。其中，‘01-26B’具有一般配合力好、特殊配合力高、高抗丝黑穗病、抗蚜虫、抗叶斑病、抗旱、抗涝、耐瘠薄等特点，是辽宁省高粱育种中重要的骨干亲本系。

1.2　田间种植方式及表型调查方法

于2020年5月在辽宁省农业科学院试验田（123.56° E，41.82° N，海拔51 m）种植亲本，并进行去雄杂交工作，获得F₁代种子后。于2020年10月在辽宁省农业科学院农作物海南育种中心（108.78° E，18.61° N，海拔301 m）对F₁代种子自交繁种，于2021年获得F₂代群体种子。2021年5月于辽宁省农业科学院试验田种植F₂分离群体以及亲本，行距0.6 m，株距0.2 m，其中亲本各种植4行。前茬作物为野生大豆。土壤类型为沙壤土。常规栽培管理。

于授粉结束后第10天利用直尺测定亲本、F₁代和F₂群体的旗叶（LA1）、第2（LA2）、第3（LA3）和第4叶（LA4）的叶长和叶宽（叶片最宽处宽度），通过公式（叶面积=叶宽×叶长×0.75^［28］）计算得到叶面积。亲本和F₁代各测量5株，并将其平均值作为表型数据。

1.3　DNA提取及质量检测

共有10个样品，分别为大叶亲本‘01-26B’、小叶亲本‘7009B’、大旗叶混池‘LA1-L’、小旗叶混池‘LA1-S’、大二叶混池‘LA2-L’、小二叶混池‘LA2-S’、大三叶混池‘LA3-L’、小三叶混池‘LA3-S’、大四叶混池‘LA4-L’以及小四叶混池‘LA4-S’。分别选取F₂分离群体中叶面积极大和极小的单株各50株的叶片置于液氮中，利用DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒DP320（天根生化科技（北京）有限公司），采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，同时使用紫外可见分光光度计Nanodrop ND-2000初步检测浓度，Qubit对DNA浓度进行精确定量。根据浓度构建混池。

1.4　文库构建、库检及测序

检验合格的DNA样品采用PerkinElmer Company（美国）的Covaris M220破碎机随机打断成长度为350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit （Illumina.Ilnc）进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1 ng/μl，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度>2 nmol/L），以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina HiSeq TM PE150测序。

1.5　测序结果分析

通过去除原始测序序列（raw reads）中含有带接头的、低质量的reads，得到可用于分析的clean reads。去除原则主要基于以下3点：1）去除带接头的reads pair；2）当单端测序read中含有的N含量超过该条read长度比例的10%时，需要去除此对paired reads；3）当单端测序read中含有的低质量（Q≤5）碱基数超过该条read长度比例的50%时，需要去除此对paired reads。

将clean reads通过BWA软件（参数：mem-t4-k32-M）比对到高粱参考基因组（https：//genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicOrganismDownload.jsf？organism=Sbicolor），比对结果经SAMTOOLS去除重复（参数：rmdup）^［29］。

采用GATK3.8软件的Unified Genotyper模块分别进行多个样本SNP的质量检测，使用Variant Filtration进行过滤，SNP位点过滤参数为cluster Window Size 4，filter Expression“QD<4.0‖FS>60.0‖MQ<40.0”，G_filter“GQ<20”。

利用ANNOVAR软件对由多个基因组检测出的基因变异进行功能注释。基于基因分型的结果，筛选2个亲本间纯合差异的标记，并选择‘01-26B’作为参考亲本，分析计算2个子代在亲本间的SNP的频率（SNP-index）。完全与参考亲本相同的SNP-index为0；完全与其不同的SNP-index为1。为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出SNP-index后的亲本多态性位点进行过滤，过滤标准如下：1）2个子代中SNP-index都<0.3，并且SNP深度都<7的位点，过滤掉；2）1个子代SNPindex缺失的位点，过滤掉。最后进行子代SNP频率差异分布Δ值计算，Δ=极端性状B变异频率—极端性状A变异频率。进行1 000次置换检验，选取95%置信水平作为筛选的阈值^［30-33］。

1.6　候选基因的定位

选择95%置信水平下，大于阈值的窗口作为候选区间。为直观反映子代SNP-index在染色体上的分布情况，对SNP-index在染色体上的分布进行作图。选择1 Mb为窗口，1 kb为步长，计算每个窗口中SNP-index的平均值来反映子代的SNP-index分布。为了不忽略掉微效QTL的影响，在全基因组范围内挑选候选SNP和InDel，如果参考亲本和子代表型相同，则挑选子代池中All-index≈0.2的位点；如果参考亲本和子代表型相反，则挑选子代池中All-index≈0.8的位点作为候选位点，对于候选的位点提取ANNOVAR的注释结果，优先挑选引起stop loss或者stop gain或者非同义突变或可变剪接位点所在的基因作为候选基因^［34］。

2　结果与分析

2.1　表型分析

2.1.1　双亲表型

由表1可知，‘01-26B’旗叶到第4叶叶面积分别为203.81、378.82、533.15和503.98 cm²，‘7009B’旗叶到第4叶的叶面积分别为96.36、254.56、322.06和394.66 cm²，‘01-26B’和‘7009B’之间的T检验结果表明，2个亲本的4个叶片间均存在极显著的差异，表明二者可以作为亲本构建分离群体，进行后续的基因定位研究。以两亲本构建的F₁代植株旗叶到第4叶叶面积分别为222.39、470.19、555.31和543.01 cm²，4个叶片的叶面积均表现出一定的超亲优势。

2.1.2　分离群体表型

由表2和图1可知，F₂群体旗叶到第4叶的叶面积平均值分别为370.81、444.11、496.90和437.27 cm²，变异系数（CV）在15.77%~21.95%，最小值分别为186.83、219.60、305.25和250.90 cm²，最大值为594.82、688.50、684.00和655.68 cm²，旗叶到第4叶的叶面积平均值、最小值和最大值均表现出逐渐增加的趋势，从群体偏度和峰度以及群体叶面积频率分布可以看出，4个叶位的叶面积均符合正态分布，可以认为高粱上四叶叶面积表型为典型的数量性状。

2.1.3　分离群体叶面积的相关分析

由图2可知，F₂群体旗叶叶面积与第2、第3、第4叶的相关系数（r）分别为0.735（P=0.000）、0.617（P=0.000）、0.877（P=0.000），第2叶与第3、第4叶间的r分别为0.754（P=0.000）、0.929（P=0.000），第3与第4叶叶面积的r为0.879（P=0.000）。可见，高粱4个叶位的叶面积间存在极显著的正相关系，推测其受到同一个或多个位点的调控。

2.2　高粱叶面积BSA定位

2.2.1　测序数据质量

由表3可知，10个样品测序数据中Total_Reads有56 932 543~86 532 442条，Total_Bases在8 539 881 450~12 979 866 300 bp，错误率在0.024 9%~0.026 9%，Q20%和Q30%分别在97.18%和92.41%以上，GC含量在43.32%~44.31%，综上，各样本测序得到的数据量足够，错误率较低，测序Q20和Q30质量合格，GC分布正常，建库测序成功。

2.2.2　参考基因组比对

将各测序样品与高粱参考基因组进行比对，比对结果去除重复后，10个样品Mapped_Reads有81 490 278~121 779 665条，平均测序深度在15.38~23.05×，1×覆盖率在91.36%~93.55%，5×覆盖率在86.68%~90.05%，10×覆盖率在68.59%~84.95%，见表4。

2.2.3　SNP变异分析

由图3可知，10个样品分别检测到1 652 180~2 033 836个SNP位点，8个子代混池经过与亲本的比对，筛选出1 513 509~1 718 684个SNP位点。10个样品位于基因下游的SNP变异个数在76 633~89 801个，位于外显子上的SNP变异在63 623~76 288个，位于基因间的变异个数在1 521 350~1 949 139个，位于基因内含子上的变异在144 999~169 826个，位于3’UTR区域内的变异个数在18 522~22 089个，位于5’UTR区域内的SNP变异位点个数在14 883~17 355个。

位于外显子上的SNP变异可分为非同义变异、同义变异、转录提前终止的变异和终止子丢失4种变异。10个样品中，非同义突变个数在32 139~38 616个，同义突变个数在30 744~36 770个，转录提前终止的变异在428~574个，终止子丢失类型的变异在109~127个（图3（b））。

2.3　高粱叶面积关键SNP发掘

2.3.1　高粱旗叶

由表5可知，在全基因组范围内共找到17个多态性位点，根据ANNOVAR注释结果可以发现1号染色体58 490 747 bp处和9号染色体3 138 723 bp处2个位点位于基因外显子上，其中，1号染色体58 490 747 bp处发生由T到G的突变，9号染色体3 138 723 bp处发生由C到G的变异。其余位点均位于基因之间。

2.3.2　高粱第2、3、4叶

由表6可知，高粱第2叶BSA共定位到31个差异性SNP位点，根据ANNOVAR注释结果可以发现有22个变异位点位于基因之间，这些位点位于3、4、5、6、8、9和10号染色体上。此外，在3号染色体12 626 178 bp处和10号染色体55 487 847和55 487 859 bp处共存在3个位于基因上游的SNP位点。在3号染色体7 767 039和7 767 041 bp处各有1个位于5’UTR区域的SNP变异位点，位于1号染色体58 490 747 bp处的碱基发生T到G的变异、7号染色体2 091 046 bp处的碱基发生C到G的变异、2 091 048 bp处的G变异为A，共存在3个位于基因外显子上的SNP位点。

高粱第3叶BSA共定位到9个差异性SNP位点，根据ANNOVAR注释结果可以发现有8个变异位点位于基因之间，其中3号染色体上的3个变异位点分别位于19 785 915、41 517 085和44 523 734 bp处，5号染色体上的SNP变异位点位于16 570 601 bp处，6号染色体上的2个SNP位点分别位于8 833 956和28 980 843 bp处，在9号染色体上2个位于基因之间的变异位点，分别位于8 348 410和21 658 676 bp。与旗叶和第2叶叶面积定位结果相同，1号染色体58 490 747 bp处存在1个位于基因外显子上的SNP位点，发生由T到G的变异（表6）。

高粱第4叶共定位到16个与第4叶叶面积相关的差异性SNP位点，根据ANNOVAR注释结果可以发现有13个变异位点位于基因之间，其中2号染色体66 231 545 bp处存在1个位点，3号染色体15 754 441、15 754 448、43 980 288和43 980 337 bp处均存在1个变异位点，5号染色体44 188 015、44 188 023和45 374 262 bp也各存在1个变异位点，6号染色体24 293 974 bp处存在1个SNP变异位点，9号染色体35 826 630和41 749 426 bp处各存在1个变异位点，此外10号染色体45 749 097和49 129 487 bp处各存在1个突变位点。在2号染色体70 469 909 bp处存在1个位于基因上游的变异位点，9号染色体6 798 781 bp处存在1个位于3’UTR区域的变异位点，与其余叶位叶面积定位结果相同，位于1号染色体58 490 747 bp处存在1个位于基因外显子上的SNP位点，发生由T到G的突变，见表6。

2.4　候选基因及等位变异

对上述4个叶位叶面积所涉及的73个相关SNP位点，去除位于基因间的58个SNP变异位点，剩余15个SNP位点均位于基因外显子、5’UTR区域、3’UTR区域或基因上游（表7）。其中，8个SNP位点位于基因外显子上，6个造成非同义突变。

位于1号染色体58 490 747 bp处的由T到G的变异在4个叶位叶面积定位中均被检测到，涉及的基因为LOC8058743（Sobic.001G302300），可以认为是“一因多效”位点。在2个数据库中均被注释为包含QWRF基序的蛋白7，该蛋白在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中被证实与皮质微管引导的纤维素微纤丝排列有关，而这一过程与细胞壁发育相关，推测其在高粱中同样会对细胞壁的伸长造成影响，进而影响高粱叶面积大小。另外，2个非同义突变均位于7号染色体基因LOC8074042（Sobic.002G337400）上，分别发生由G到A和由A到G的变异，此外，该基因上还存在1个同义变异，发生由C到G的变异，位于该基因上的3个变异位点均与第2叶叶面积大小相关，该基因编码的蛋白在NR数据库中为未表征蛋白，但是在UniProt数据库中则被注释为叶绿体导入装置2。最后一个位于外显子上的SNP位点为在9号染色体基因LOC8068196（Sobic.009G034300）上的由C到G的变异，与旗叶叶面积相关，该基因在2个数据库中均被注释为酰基转移酶4。

有2个位点位于基因5’UTR区域，均与第2叶叶面积相关，且都在3号染色体基因LOC8070406（Sobic.003G089200）上，分别发生由G到A的突变和由C到T的突变，NR数据库注释为核仁素，而UniProt数据库则没有注释到该基因的功能，核仁素是细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，不但直接参与核糖体的生物合成和成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制、核仁发生等过程。位于基因3’UTR区域的变异位点只有1个，位于9号染色体基因LOC8080955（Sobic.009G064000）上，发生由A到G的变异，该基因编码的蛋白在2个数据库中均为未表征蛋白，功能尚不明确。

位于基因上游区域共有4个位点，其中位于3号染色体基因LOC8078117（Sobic.003G134100）上的变异位点与第2叶叶面积相关，发生由T到C的突变，该基因在2个数据库中的注释均为真核翻译起始因子6-2；此外还有2个位于10号染色体基因LOC8058435（Sobic.007G023100）上的变异位点与第2叶叶面积相关，分别发生由T到A和由A到T的变异，该基因在2个数据库中均被注释为GDSL酯酶/脂肪酶At5g55050，该酶在植物的生长发育、形态发生、种子油分合成和防御反应中发挥重要的生物学功能，最后1个位于2号染色体基因LOC8081743（Sobic.002G337400）上，与第4叶叶面积相关，发生由G到A的变异，2个数据库中均被注释为花青素5，3-O-葡萄糖基转移酶。

3　讨 论

传统的凝胶电泳定位QTL方法，需要分子标记的开发，遗传图谱的构建，以及大量的表型鉴定才能实现，需耗费大量的人力和财力^［17］。但利用BSA-seq方法则免去了图谱构建的过程，同时可以对后代进行高效的基因分型。所以BSA-seq方法已成为育种者进行快速定位主效QTL和挖掘各种不同作物目标性状基因的一种有效方法^［35-37］。目前，利用BSA-seq方法已经在水稻和高粱中鉴定到了许多调控农艺性状的QTL以及基因。Yao等^［35］利用2个关联重组自交系对水稻千粒重QTL进行了多环境定位，找到稳定表达的主效QTL后，利用BSA-Seq作图法将10号染色体上的主效QTL缩小到1.47 Mb的染色体区间。Sun等^［36］以‘东农425’和‘长白10号’为亲本构建的RILs群体为试材，在连续2年的大田环境下进行水稻耐碱性鉴定，QTL定位和BSA-Seq结果比较分析，将目标区间缩小至2号染色体上24.038—24.154 Mb处，约为116 kb的范围内，该区域共有18个基因，根据基因注释预测出11个水稻耐碱候选基因。Han等^［37］利用QTL-mapping和BSA-Seq结合的方法，将高粱茎秆水分含量位点定位在6号染色体48.279—48.618 Mb，约339 kb之内，获得了38个候选基因。由此可见，BSA-seq测序技术已经成为基因分析的一个重要工具，提供了前所未有的高分辨率基因型信息，能更准确地定位到主效QTL，使许多传统意义上操作困难、耗时和昂贵的基因检测方法被快速和相对便宜的检测技术所取代，加快了对复杂性状QTL的检测速度。

叶面积作为影响作物光合效率和产量的关键性状，在禾本科作物中普遍表现为数量性状，受多基因控制^［6-7］。近年来国内外学者已经对高粱叶长和叶宽等性状进行了初步定位。Nida等^［38］在1、3、8号染色体定位到5个与叶长有关的QTL位点，在1、3号染色体上定位到了2个与叶长有关的QTL位点。Lu等^［39］利用高粱-苏丹草杂交种F₂种群结合包含5 656个SNP标记的遗传连锁图谱在3个环境中定位到7个与高粱第2叶叶长相关的QTL，分别位于3、4、7、8和10号染色体上，其中10号染色体上的QTL为稳定QTL；还定位到了12个与叶宽相关的QTL分别位于4、5、8和9号染色体上，其中4号染色体上的位点为稳定QTL，且qLW-4-4（170.61 cM），表型变异高达25.95%，是叶宽的主要效应位点。石悦等^［40］以散穗高粱×红壳苏丹草的杂种F₂代分离群体结合高密度AFLP分子标记遗传图谱定位到11个叶长相关的QTL，遗传贡献率在8.8%~37.1%。本研究在1号染色体58 490 747 bp处定位到的“一因多效”位点与Zhi等^［19］定位到的qLW_dtf1.3位置接近，二者物理距离相差约1.05 Mb。这暗示该基因组区域可能是调控高粱叶形性状的热点区域。但是本研究中大多数位点与Zhi等^［19］和Zou等^［20］研究结果重合度较低，可能由于本研究定位的位点与先前研究不重合，揭示了叶面积性状遗传结构的复杂性和多样性，以及在不同遗传和环境条件下，不同基因或基因组合可能发挥不同的作用。为了更全面地理解叶面积性状的遗传基础，未来的研究可以进一步整合不同研究的数据和资源，采用多组学方法，如基因组学、转录组学和表观遗传学等深入探索叶面积的遗传调控机制。同时，通过在不同环境条件下进行重复验证，以便确认和解析这些位点的真实效应和互作关系，为作物遗传改良和分子育种提供更为准确和可靠的依据。

4　结 论

采用BSA-seq技术，以叶面积存在显著差异的高粱保持系‘01-26B’和‘7009B’为亲本构建F₂分离群体，成功对4个叶位的叶面积控制基因进行了定位与候选基因挖掘。结果表明，高粱叶面积表现为典型数量性状，且各叶位间叶面积存在极显著正相关，基于高质量测序数据，分别在4个叶位筛选到总计73个与叶面积显著相关的SNP位点。其中，15个位点位于基因功能区。其中，1号染色体58 490 747 bp处鉴定出1个由T到G的关键突变，该位点在4个叶位的定位中均被重复检测到，推测其是1个调控多叶位叶面积的“一因多效”主效位点。

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基金资助

辽宁省应用基础研究计划(2025JH2/101300075)

辽宁省农业科学院协同创新专项(2025XTCX0401-2-3)

国家现代农业产业技术体系(CARS-06-14.5-A11)

辽宁省农业科学院农业绿色高质量发展项目(2025HQ1307)

辽宁省藏粮于技重大专项(2023JH1/10200001)

沈阳市种业创新专项(24-215-2-02)

辽宁省农业科学院科技创新专项(2026JC4003)