原代绵羊骨骼肌-前体脂肪细胞共培养体系建立

Establishment of a primary skeletal muscle-preadipocyte co-culture system from sheep

摘要

本研究旨在探索原代绵羊骨骼肌细胞与前体脂肪细胞共培养体系并确立最适培养条件，以绵羊背最长肌和皮下脂肪为研究对象，分离培养2种细胞后，在DMEM与DMEM/F12（1∶1）混合培养基中按1∶1细胞比例建立共培养体系，通过调整胎牛血清浓度（15%、12.5%、10%、8%、5%）研究其对骨骼肌细胞活性的影响。在共培养48 h期间，采用实时细胞生长曲线监测、细胞形态和台盼蓝染色评估细胞活性。结果表明：1）15% FBS组得到2.395×10⁶个细胞，台盼蓝染色显示死亡率分别为32%，细胞总量最多，死亡率最高；2）12.5% FBS组和10% FBS组分别得到1.185 × 10⁶个细胞和9.55×10⁵个细胞，死亡率为10%和7%；适当降低FBS浓度可减少细胞死亡；3）8% FBS与5% FBS组因营养匮乏得到8.225×10⁵与2.85×10⁵个细胞，死亡率分别为7%与6%。综上，10% FBS可在维持较高细胞数量的同时有效控制死亡率，是实现绵羊骨骼肌细胞与前体脂肪细胞高效共培养的最佳血清浓度。本研究为反刍动物研究糖脂代谢提供细胞技术支持。

Abstract

This study aimed to explore the co-culture system of primary sheep skeletal muscle cells and preadipocytes and establish the optimal culture conditions. The longissimus dorsi muscle and subcutaneous adipose tissue of sheep were used as the research objects. After isolating and culturing the two types of cells， a co-culture system was established in a mixed medium of DMEM and DMEM/F12 （1∶1） with a 1∶1 cell ratio. The effects of different fetal bovine serum （FBS） concentrations （15%， 12.5%， 10%， 8%， 5%） on skeletal muscle cell viability were investigated. During the 48-hour co-culture period， real-time growth curve monitoring， cell morphology observation， and trypan blue staining were used to assess cell viability. The results showed that： 1） The 15% FBS group yielded 2.395 × 10⁶ cells， and trypan blue staining showed a mortality rate of 32%， with the highest total cell count and mortality rate. 2） The 12.5% FBS group and the 10% FBS group yielded 1.185 × 10⁶ cells and 9.55 × 10⁵ cells， with mortality rates of 10% and 7%， respectively； Properly reducing the FBS concentration can decrease cell death. 3） Due to nutrient deficiency， the 8% FBS and 5% FBS groups yielded 8.225×10⁵ and 2.85×10⁵ cells， with mortality rates of 7% and 6%， respectively. In conclusion， 10% FBS maintains high cell numbers while effectively controlling mortality， representing the optimal serum concentration for efficient co-culture of sheep skeletal muscle cells and preadipocytes. This study provides cellular technical support for on the study of glucose and lipid metabolism in ruminant animals.

Graphical abstract

关键词

绵羊 / 骨骼肌细胞 / 前体脂肪细胞 / 共培养体系

Key words

sheep / skeletal muscle cells / preadipocytes / co-culture system

绵羊作为典型的反刍动物，其糖脂代谢具有独特的生理特征，与以葡萄糖为主要能量来源的非反刍动物不同，绵羊的能量供应主要依赖于瘤胃发酵产生的挥发性脂肪酸。这一差异决定了其骨骼肌和脂肪组织在代谢感知、底物利用及胰岛素敏感性等方面具有独特的调控机制^［1］。同时，绵羊脂肪代谢还表现出高度的可塑性及季节性节律，使得其能量稳态调控远比非反刍动物复杂。因此，深入揭示绵羊糖脂代谢的调控机制，不仅是反刍动物生理学的重要科学问题，也对优化养殖生产、改善肉品质具有实际意义。骨骼肌作为机体葡萄糖利用的主要器官，与前体脂肪细胞之间存在密切的联系共同来源于中胚层细胞，这种细胞间的互作，通过旁分泌等信号形式，在调控肌内脂肪沉积、能量代谢平衡及肌肉发育过程中发挥着关键作用^［2］，例如，Choi等^［3］和Xu等^［4］均运用Transwell共培养研究了牛和滩羊的肌-脂互作。然而，动物体环境的高度复杂性为直接研究这2种细胞的交互机制带来了挑战。因此，建立能够模拟体内微环境的体外模型，成为该科学问题的关键技术手段。

目前，关于糖脂代谢的细胞互作研究多集中于非反刍动物模型。然而，由于物种间代谢模式的根本性差异，这些研究无法直接套用于绵羊。即便在有限的反刍动物研究中，也存在2个主要局限：一是模型失真，单一细胞培养方法难以模拟体内真实的生理环境，导致体外与体内试验结果常缺乏一致性^［5］；二是模型混杂，现有的共培养研究多采用非同一来源的细胞系，忽略了细胞在体内原有的空间邻接关系，可能掩盖了真实的组织特异性互作。

针对上述难点，要真实反映绵羊糖脂能量代谢机制，必须在体外模型中最大程度地保留其原位微环境特征。因此，本研究提出一种“同源、同部位”的细胞模型构建策略。具体而言，本研究突破常规分别取材的方式，只从同一只绵羊的同一解剖位点（背最长肌及紧邻的皮下脂肪）成对采样，进行骨骼肌细胞与前体脂肪细胞的原代同步分离。利用Transwell间接共培养体系，该模型既能通过旁分泌因子研究细胞通讯，又能保持2种细胞群体的独立性与纯度，从而提高研究的可靠性与可重复性^［6］。

这一模型的核心科学价值在于：从源头模拟了特定生长部位内，肌肉与脂肪组织在发育过程中最真实的细胞互作背景，可替代部分体内实验减少对动物实验的依赖。它不仅为揭示绵羊糖脂代谢调控的内在联系提供了更贴近生理实际的研究平台，也为后续深入探究肌内脂肪沉积、能量代谢平衡等关键科学问题奠定了可靠的技术基础，并为反刍动物精准营养与遗传育种提供了重要的体外验证平台和理论参考。

1　材料与方法

1.1　试验动物及试验材料

本研究自通辽市科尔沁区某绵羊屠宰场采集三月龄绵羊背最长肌和皮下脂肪为试验样本，将样品75%酒精消毒后，PBS冲洗干净存放于含有青链霉素的PBS中，置于4 ℃冰袋泡沫箱中，3 h内带回实验室。Transwell小室购自洁特生物有限公司（广州）；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）购自（XP Biomed，上海）；DMEM/F12、DMEM和0.25%胰蛋白酶购自（Gibco，USA）；胶原酶Ⅱ购自（Sigma，USA）；罗格列酮、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1- methylxanthine，IBMX）、胰岛素和DAPI等购自碧云天生物技术有限公司（上海）；磷酸缓冲盐溶液（Phosphate buffered saline，PBS）等购自Hyclone 公司（北京）；4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100、饱和油红O染料和苏木素染料等购自Solarbio公司（北京）；肌肉细胞标志物α-肌动蛋白（α-actin）等抗体购自博奥森公司（北京）。

1.2　试验方法

1.2.1　绵羊骨骼肌细胞和前体脂肪细胞的分离培养

本试验采用组织块法分离绵羊骨骼肌细胞，于75%酒精中消毒30 s，在含5%三抗PBS（青霉素、链霉素、两性霉素）洗涤3次，去除血管筋膜与脂肪组织后切成1 mm³左右的肌肉小块，将组织块间隔0.5 cm依次放入100 mm的细胞培养皿中，待其略微干燥后加入10% FBS DMEM培养液，于37 ℃、5% CO₂条件的培养箱（Yamato，日本）中培养，待细胞生长约70%时弃掉组织块，利用差速贴壁法纯化绵羊骨骼肌细胞，继续培养至80%进行消化和传代。

采用酶消化法分离绵羊前体脂肪细胞，同样方法消毒剪碎，将处理好的脂肪组织放于其三倍体积的0.1%胶原酶Ⅱ，于水浴锅中消化2 h，依次过100目和40目细胞筛，离心弃去上清得到细胞沉淀，加入培养基重悬细胞接种于细胞培养皿中，20% FBS DMEM/F12，于37 ℃、5% CO₂条件培养，培养3 h后利用差速贴壁法进行纯化，继续培养待细胞生长约80%时进行消化和传代。

1.2.2　绵羊骨骼肌细胞和前体脂肪细胞的鉴定

为了鉴定骨骼肌细胞和前体脂肪细胞，本试验通过免疫荧光（IF）试验和饱和油红O染色进行验证。将骨骼肌细胞PBS润洗3次后弃去上清，4%多聚甲醛固定细胞20 min，0.1% Triton X-100通透细胞15 min，5% FBS封闭细胞30 min，避光下使用α-actin（1∶300）孵育过夜后，使用山羊抗兔二抗（1∶500）室温避光孵育1 h，最后用DAPI复染细胞核5 min，骨骼肌细胞呈阳性信号呈绿色。将前体脂肪细胞接种加入诱导分化培养基：1.72 μmol/L 胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5mm mol/L IBMX和10% FBS DMEM/F12，诱导分化72 h，再加入维持诱导剂1.72 μmol/L胰岛素和10% FBS DMEM/F12诱导3 d，维持结束后加入10% FBS DMEM/F12培养24 h，镜下可见脂滴，细胞诱导结束。PBS洗涤细胞两次弃去上清，4%多聚甲醛固定20 min后弃去，蒸馏水润洗后60%异丙醇浸洗细胞30 s，饱和油红O染料避光染色20 min，60%异丙醇洗涤染料，苏木素核染3 min，蒸馏水润洗2~5次洗去染料，脂滴会被染成红色，利用IX73倒置显微镜（Olympus，日本）进行图像捕捉。

将鉴定后的2种细胞分别置于活细胞观测站Lux3 FL（Axion BioSystems，USA）上，每4 h采集一次，采集48 h后，计算并绘制生长曲线评估细胞的增殖活性是否符合细胞生长阶段，确保后续试验结果可靠。

1.2.3　绵羊骨骼肌-前体脂肪细胞共培养体系的构建

为探究2种细胞共培养最适的培养条件，本试验将骨骼肌细胞与前体脂肪细胞两种不同的培养基分别按照不同的血清浓度进行1∶1混合，即15%、12.5%、10%、8%和5%浓度的血清的培养基进行1∶1混合。将骨骼肌细胞和前体脂肪细胞分别复苏传代后，用0.25%胰蛋白酶消化3 min，终止消化离心后，重悬制成1 mL的细胞悬液，吸取 10 μL加入到血球计数板中统一计数，骨骼肌细胞与前体脂肪细胞采用1∶1的细胞比例分别接种在6孔板底部和0.4 μm Transwell小室内部中，加入适量配置好的培养基分别培养，将细胞置于37 ℃和 5% CO₂的环境中贴壁2~3 h， 3 h后镜下观察贴壁情况，细胞贴壁70%~80%后将小室细胞（前体脂肪细胞）缓慢置于6孔板（骨骼肌细胞）上，将其置于37 ℃和5%CO₂培养箱中培养48 h，使2种细胞可充分交互（图1）。

1.2.4　不同血清浓度共培养体系下前体脂肪细胞对骨骼肌细胞增殖活性的影响

为了测定不同血清浓度共培养体系下前体脂肪细胞对骨骼肌细胞增殖活性的影响，本研究将含15%、12.5%、10%、8%和5%血清的共培养体系，分别于活细胞观测站Lux3 FL上进行监测，每4 h采集一次细胞图像，持续48 h，据此绘制生长曲线并结合台盼蓝染色评估前体脂肪细胞对骨骼肌细胞增殖活性的影响，在图像采集结束后，每份样本随机选取3个不同视野的图像，并且每张图像采取同一部分局部图利用imagej进行细胞长宽比的量化分析，并且收集培养基上清，离心重悬以回收上清中的死细胞。随后，润洗剩余贴壁细胞，以0.25%胰蛋白酶消化5 min，消化结束后离心并重悬。将上清中的细胞与消化后收集的细胞合并混合，进行台盼蓝染色后，使用血细胞计数板进行细胞计数（每次重复试验计数3次，取平均值）据此计算细胞存活率与死亡率。

1.2.5　统计分析

利用Graph Pad prism 10对数据进行分析，采用ANOVA来评估各组之间的差异，P<0.05表示差异显著，P<0.001表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1　绵羊骨骼肌细胞的分离与鉴定

本研究通过组织块法成功分离得到绵羊骨骼肌细胞。当绵羊背最长肌组织块贴壁培养3 d，可观察到细胞从组织块边缘呈放射状迁出（图2（a）），在初期培养阶段，常伴有成纤维细胞等杂细胞的混杂生长，待细胞增殖至约70%汇合度时移除组织块，通过差速贴壁法进行纯化继续生长（图2（b）），最终获得形态均一的绵羊骨骼肌细胞，骨骼肌细胞呈现典型的长纤维状形态：细胞两端呈渐细的锥形，继续培养完全汇合时细胞呈现规律性排列，光学显微镜下可见明显的横纹结构（图2（c））。免疫荧光鉴定结果显示，蓝色为DAPI表达在细胞核上，细胞核为扁卵圆形，核仁结构清晰可见（图2（d）），骨骼肌细胞中可见强烈的α-actin阳性信号，表现为沿肌纤维排列的强绿色荧光信号呈横纹状结构，细胞质中也呈现规律的表达，符合骨骼肌肌动蛋白在肌纤维中的表达定位特征（图2（e）），合并色为Merge（图2（f））。

2.2　绵羊前体脂肪细胞分离与鉴定

本研究通过酶消化法成功得到绵羊前体脂肪细胞，24 h时贴壁细胞呈现短梭形或三角形，零散分布于培养表面（图3（a）），2~3 d开始增殖细胞数量显著增加（如图3（b）），培养7 d可达致密单层状态（图3（c））。本研究发现，在基础培养基中培养时，几乎不会出现脂滴积累现象，细胞维持前体状态的能力较强，分化过程严格依赖外源性诱导因子的刺激。前体脂肪细胞是一类存在于脂肪组织中的多功能祖细胞，具有向成熟脂肪细胞分化的潜能，在加入诱导分化培养基培养72 h后，前体脂肪细胞的形态发生明显变化，由最初的纤维状逐渐转变为椭圆形（图3（d）），并开始出现少量脂滴；更换维持诱导剂继续培养3 d，细胞内脂滴数量显著增多（图3（e））；维持诱导结束后，改用10% FBS DMEM/F12培养基培养24 h并进行饱和油红O染色，可见细胞内脂滴被特异性染成红色，细胞核被苏木素染成紫色（图3（f））。结果表明，前体脂肪细胞成功分化为成熟脂肪细胞，鉴定为前体脂肪细胞。

2.3　绵羊骨骼肌细胞、前体脂肪细胞增殖活性生长曲线分析

细胞生长阶段可划分为潜伏期、对数期和平台期，两种细胞均在0~4 h内处于潜伏期，细胞数无显著增长，细胞处于适应环境恢复代谢活性的阶段，而4~36 h内均进入对数期，细胞进入增殖最活跃的阶段，细胞适应环境后代谢旺盛呈指数增长，而36 h后进入平台期，细胞增殖速率与死亡速率达到动态平衡保持相对稳定，这一阶段出现生长抑制，代谢废物积累和营养耗竭等生长限制（图4）。 2种细胞均满足潜伏期、对数期和平台期符合细胞生长增殖可用于下一步试验。

2.4　不同血清浓度共培养体系下前体脂肪细胞对骨骼肌细胞增殖活性影响

本研究通过建立骨骼肌细胞与前体脂肪细胞的共培养模型，施加不同浓度的血清条件并利用台盼蓝染色旨在探究上层前体脂肪细胞对下层骨骼肌细胞增殖行为的影响。骨骼肌细胞生长曲线结果（图5）所示，台盼蓝结果见图6，15%血清浓度时于28 h进入平台期，台盼蓝染色计数细胞总数为2.395×10⁶，死细胞数为7.664×10⁵，死亡率为32%，总细胞数和死亡率皆极显著高于其他组；12.5%血清浓度时32 h进入平台期，台盼蓝染色计数后细胞总数为1.185×10⁶，死细胞数为1.185×10⁵，死亡率为10%随着血清浓度递减死亡率显著减少；10%血清浓度则在36 h进入平台期，但是都于48 h汇合度达到100%，台盼蓝染色计数后细胞总数为9.55×10⁵，死细胞数为6.685×10⁴，死亡率降低至7%差异显著减小；而当血清浓度逐渐下降为8%时，增殖速度变缓细胞总数减少，48 h汇合度为98%，台盼蓝染色计数后细胞总数与10%相比差异不显著为8.225×10⁵，但是48 h未进入平台期，死细胞数为5.757 5×10⁴，死亡率为7%；而降至5%血清浓度时细胞增殖速度受损更为严重，5%细胞总数显著低于8%，表明5%营养匮乏细胞已不能维持正常的增殖活力，且48 h时未进入平台期汇合度仅有93%台盼蓝染色计数后细胞总数仅为2.85×10⁵，死细胞数为1.71×10⁴死亡率为6%。

2.5　不同血清浓度下绵羊骨骼肌-前体脂肪细胞共培养体系骨骼肌细胞形态学分析

不同血清浓度共培养体系下培养48 h前体脂肪细胞对骨骼肌形态影响见图7，15%血清浓度时骨骼肌细胞呈细长的纤维状长宽比显著高于其他组，过度聚集密集成片并产生明显的代谢废物（图7（a））；12.5%血清浓度时骨骼肌细胞呈长纤维状，由于营养化减轻产生的代谢废物明显减少细胞长宽比显著低于15%（图7（b））；10%血清浓度时长宽比显著低于12.5%，细胞形态正常无明显代谢废物（图7（c））；而当血清浓度降至8%时，细胞形态明显发生扁平长宽比显著低于10%（图7（d））；血清浓度继续减少至5%时细胞形态立体感变差长宽比显著低于8%，表现为细胞伸展和伪足样结构增多（图7（e）），细胞长宽比结果（图7（f））所示。

3　讨 论

3.1　绵羊骨骼肌细胞和前体脂肪细胞共培养体系的建立

共培养体系一直被用于研究细胞群之间的相互作用，并且是任何类型的细胞间相互作用研究的基础，其还被用来研究种群之间的自然相互作用^［7］，相比传统培养，该方法更接近生理微环境，能更好地研究细胞通讯、旁分泌效应及ECM重塑等，有望替代部分体内试验^［8］减少对动物试验的依赖，该体系不仅为揭示绵羊糖脂代谢调控的内在联系提供了更贴近生理实际的研究平台，也为深入探究肌内脂肪沉积、能量代谢平衡等关键科学问题奠定了坚实的技术基础。

共培养体系的建立需综合优化培养条件、材料与监测技术，以构建更接近生理状态的体外模型^［9］。本研究选择0.4 μm膜孔径的小室，这取决于细胞类型、细胞直径、细胞周期进程和细胞活力等因素^［10］，这与Dietze等^［11］在人脂肪细胞和人骨骼肌细胞共培养的研究一致，另外，Choi等^［12］同样使用0.4 μm膜孔径的小室操作一致。培养基选择是细胞培养的关键，不同细胞类型对营养成分有特定需求，共培养体系中，优化血清浓度与培养基兼容性，以同时满足多种细胞生长需求^［13］，是体系成功的关键。

3.2　不同血清浓度共培养体系下骨骼肌细胞生长曲线和细胞活性影响

在细胞培养过程中，针对不同细胞类型及其对血清浓度的独特需求，本研究采取了将两种培养基进行1∶1混合的策略并且设立不同的血清梯度以期达到平衡。然而，试验结果显示，在15%和12.5%的血清浓度中细胞生长速率最快于培养 28 h和32 h进入平台期，甚至出现富营养化的情况，表明过高浓度的血清导致代谢产物积累过快从而间接影响细胞健康和功能^［14］。相比之下，10%血清浓度下细胞生长速度正常是一个相对平衡的血清补充水平，而8%和5%血清浓度下细胞生长缓慢未到达平台期，甚至细胞损伤严重，明确表明在当前混合培养基条件下，这些浓度不足以支持细胞的增殖导致营养限制^［15］。在前体脂肪细胞与骨骼肌细胞共培养体系中，通过优化培养基成分、调控细胞接种比例、干预旁分泌信号通路并结合实时生长监测与动态反馈，可有效实现二者的同步生长，从而提升实验的可靠性。

在高血清浓度15%和12.5%条件下，骨骼肌细胞因过早进入平台期而大量产生活性氧，进而激活细胞周期阻滞与凋亡通路，破坏能量代谢与蛋白质稳态，最终导致显著升高的细胞死亡率^［16］。后续研究结果发现，当血清浓度为10%时，骨骼肌细胞在培养36 h后进入平台期，细胞死亡率显著降低至仅7%，且在 48 h达到100%汇合度表明细胞生长状态达到最佳这一结果与Ma等^［17］研究方法一致。这表明适当降低血清浓度，可以避免富营养化引起的过度增殖和ROS累积，从而实现最佳的细胞生长状态。

进一步优化细胞培养条件时发现，在血清浓度降低至8%和5%的情况下，骨骼肌细胞出现了不同程度的增殖速度减缓和凋亡，细胞总数减少，正如吴森等^［18］在牛肌肉卫星细胞共培养中添加5% FBS的细胞活性最低结果一致。在低血清条件下，骨骼肌细胞虽增殖减缓、汇合度不足且部分发生凋亡，但仍能维持基础生长与存活，其机制在于共培养的前体脂肪细胞通过脂解作用释放游离脂肪酸^［19］；这些脂肪酸被骨骼肌细胞摄取后，在线粒体内经β-氧化生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环与氧化磷酸化途径，产生ATP作为葡萄糖匮乏时的替代能源^［20］，从而支撑其基础代谢、有限增殖及细胞存活。

3.3　不同血清浓度共培养体系下对骨骼肌细胞形态的影响

当血清浓度达到15%时，骨骼肌细胞出现过度增殖，细胞密度过高，长宽比值最高，形成致密纤维状结构，接触抑制机制被破坏，导致代谢废物堆积和细胞死亡，表明过高血清虽促进增殖，但不利于细胞形态维持及正常生理功能的稳定导致死亡^［21］。在12.5%血清浓度下，降低血清使增殖速度趋于平稳减少死亡但细胞仍呈现过密状态；10%浓度时细胞密度适宜，形态维持正常梭形和纤维状；而8%和5%浓度则因营养匮乏导致细胞骨架异常、形态扁平化长宽比缩小，表明血清浓度的梯度变化直接影响骨骼肌细胞的增殖平衡与肌源性形态维持，肌动蛋白受损使细胞无法保持正常形态。综上，本研究通过试验综合对比发现，将DMEM与DMEM/F12按1∶1混合并添加10%FBS，在细胞比例1∶1时共培养效果最佳，这与Battiston等^［22］在骨祖细胞与内皮细胞共培养中得出的结论一致。

3.4　绵羊骨骼肌细胞和前体脂肪细胞共培养体系的建立的科学意义

绵羊骨骼肌细胞与前体脂肪细胞共培养体系的建立，旨在构建一种更接近生理状态的体外模型，以深入探究绵羊特有的糖脂代谢机制，该体系填补了反刍动物代谢研究中缺乏功能性共培养平台的空白，通过模拟体内细胞间相互作用，为研究肌肉-脂肪轴调控提供了可定量、可重复且种属特异的实验平台。相比传统体内试验，该体系解决了周期长、成本高、干预难度大及伦理问题等弊端，实现高通量靶点筛选与分子机制验证。总而言之，绵羊骨骼肌细胞与前体脂肪细胞共培养体系的建立，不仅填补了绵羊代谢研究中缺乏功能性共培养平台的空白，更通过提供一个精准、高效、可控的体外模型，为反刍动物肌肉-脂肪轴的深入研究提供了依据。这对深入理解绵羊糖脂代谢的生理病理过程，开发针对性的饲养策略和疾病干预措施，具有重要的理论和科学意义。

4　结 论

本研究成功构建了绵羊骨骼肌细胞和前体脂肪细胞共培养体系，探究了不同血清浓度对共培养体系的影响并建立了完善的体系，结果表明，共培养2种细胞且营养需求不同时，10% FBS浓度2种培养基1∶1混合时可满足生长需求并实现最佳的细胞生长状态，该研究结果为研究肌肉-脂肪组织互作提供一个有效的试验模型，为反刍动物研究糖脂代谢提供细胞技术支持，为畜牧业的糖脂代谢等发展提供方法和支持。

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基金资助

国家自然科学基金项目(32260812)

内蒙古自治区重点研发和成果转化计划(2023YFDZ0027)

内蒙古自治区重点研发和成果转化计划(2025YFDZ0135)

内蒙古自治区“高等学校青年科技人才发展项目(2023NJYT23015)

内蒙古自治区教育厅一流学科科研专项(YLXKZX-NMD-009)