DNMT1基因在牛胎盘及组织中的印记特征分析

Analysis of imprinting characteristics of DNMT1 in bovine placenta and tissues

摘要

为分析DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）基因在牛胎盘和其他组织中的等位基因表达和DNA甲基化状态，揭示DNMT1基因在牛各组织中的印记状态，本研究通过对3个胎盘（1~3）及其亲本的DNA进行全基因组测序（Whole genome Sequencing，WGS），寻找有效的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点；转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）分析基因的等位基因表达状态；全基因组重亚硫酸盐测序（Whole genome bisulfite sequencing，WGBS）分析DNA甲基化状态。结果表明：1）在DNMT1基因的外显子上共有12个有效的SNP位点，3个胎盘中分别为0、12和12个，DNMT1在胎盘2中呈现母源等位基因表达，而在胎盘3中为双等位基因表达。2）应用基于SNP的RT-PCR产物直接测序法对其他17个胎盘进行分析，利用SNP（rs211542364）区分等位基因，在17个胎盘组织中发现了10个杂合子胎盘，其中有2个胎盘呈现母源等位基因表达，其余胎盘为双等位基因表达。3）利用该SNP位点，发现DNMT1基因在7头成年牛的6个组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑）中，呈现双等位基因表达状态。4）WGBS数据分析DNMT1基因位点的4个CpG岛，CpG：89呈现低甲基化状态，其他3个CpG岛（CpG：18、CpG：18和CpG：33）呈现高甲基化状态，未发现差异甲基化区（Differentially methylated regions，DMRs）。5）亚硫酸盐测序法分析DNMT1基因启动子和外显子1区域的CpG：89在母源等位基因表达和双等位基因表达的胎盘中均呈现低甲基化状态，提示DNMT1基因位点的DNA甲基化修饰不调控DNMT1基因在牛胎盘中的多态性印记表达。综上，DNMT1基因在牛胎盘中是一个多态性印记基因，在牛的其他组织中呈现双等位基因表达。其印记的调控不受DNA甲基化修饰的调控。本研究为进一步探究DNMT1基因的功能以及印记调控机制提供参考依据。

Abstract

To investigate the allelic expression and DNA methylation status of the DNA methyltransferase 1 （DNMT1） gene in bovine placenta and other tissues， and to reveal the imprinting pattern of the DNMT1 gene in various bovine tissues， whole genome sequencing （WGS） was performed on genomic DNA from three placentas （1-3） and their parental samples to screen the single nucleotide polymorphism （SNP）； Transcriptome sequencing （RNA-seq） was to analyze the allelic expression pattern of DNMT1 gene and whole genome bisulfite sequencing （WGBS） was conducted to detect the DNA methylation status of DNMT1 locus. The results were as follows： 1）A total of 12 valid SNP loci were identified in the exons of the DNMT1 gene， with 0， 12 and 12 loci detected in the three placentas， respectively. DNMT1 exhibited maternal allelic expression in placenta 2， while biallelic expression was observed in placenta 3. 2）SNP-based direct sequencing of RT-PCR products was applied to analyze another 17 placental samples， with the SNP rs211542364 used to distinguish parental alleles. Among the 17 placental tissues， 10 were identified as heterozygous placentas， of which two displayed maternal allelic expression and the others showed biallelic expression， which verified the above conclusion. 3）Using the same SNP locus， the DNMT1 gene was found to exhibit biallelic expression in 6 tissues （heart， liver， spleen， lung， kidney and brain） from 7 adult cattle. 4）Analysis of WGBS data revealed that among the four CpG islands at the DNMT1 gene locus， CpG：89 was hypomethylated， while the other three CpG islands （CpG： 18， CpG： 18 and CpG： 33） showed hypermethylation， and no differentially methylated regions （DMRs） were detected. 5）Bisulfite sequencing further confirmed that CpG： 89， located in the promoter and exon 1 regions of the DNMT1 gene， was hypomethylated in both placentas with maternal expression and biallelic expression.These findings suggest that DNA methylation modification at the DNMT1 gene locus can not regulate the polymorphic imprinted expression of the DNMT1 gene in bovine placenta. In summary， DNMT1 acts as a polymorphic imprinted gene in bovine placenta， but is expressed biallelically in other bovine tissues. Its imprinted expression is not controlled by DNA methylation. This study provides a reference for further exploring the function and imprinting regulatory mechanism of DNMT1 gene.

Graphical abstract

关键词

DNMT1 / 基因组印记 / DNA甲基化 / 牛

Key words

DNMT1 / genomic imprinting / DNA methylation / cattle

基因组印记（Genomic imprinting）是发生在哺乳动物中的一种表观遗传学现象，指亲本染色体发生特异性表观遗传修饰后，致使子代仅表达来自亲本一方染色体的基因，而另一方同源染色体上基因不表达或极低水平表达^1］。具有这种特异性表达的基因被称为印记基因（Imprinted gene）。大部分印记基因在染色体上成簇存在^［2］，在不同的物种中具有保守性^［3］。DNA甲基化修饰是基因组印记的最主要调控机制^［4］，由于亲本等位基因甲基化修饰程度的不同，从而形成差异甲基化区（Differentially methylated regions，DMRs）^［5］。印记基因在维持生物体正常生命活动中发挥重要作用^［6］，不仅参与调控胚胎和胎盘的生长发育、影响疾病的发生和发展、还和家畜的某些生长性状密切相关^［7］。

目前，被鉴定的印记基因有200多个，主要集中在人与小鼠中^［8］。牛不仅是一种重要的经济类家畜，由于其在胚胎阶段的发育与人类极为相似，可以作为研究人类胚胎发育的模式生物^［9］，然而牛中鉴定的印记基因数量约为78个（https：//geneimprint.com），羊中36个，远远低于人与小鼠中印记基因的数量。DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）基因位于人19号染色体上，编码的DNA甲基转移酶在维持和稳定生物体甲基化模式中起重要作用^［10］。在小鼠中Dnmt1基因在雄性种系印记的维持和重建中发挥作用^［11］，可通过DNA甲基化抑制逆转录元件从而影响小鼠早期胚胎的发育^［12］。在绵羊的研究中表明DNMT1可参与母羊初情期启动的调控^［13］。DNMT1基因首先在人的胎盘中被鉴定为父源等位基因表达的印记基因，并且其表达受启动子区域的一个差异甲基化区调控^［14］。目前，DNMT1基因只在人中被鉴定为印记基因，在小鼠和包括牛羊在内的反刍动物中的印记状态和调控机理尚不明确。随着新一代高通量测序技术的发展，全基因组测序、转录组测序、全基因组重亚硫酸盐测序等技术广泛应用于基因组印记的研究^［15］。本研究通过基因组、转录组和甲基化组测序联合分析牛DNMT1基因的印记和甲基化状态，为丰富牛基因组印记研究，揭示DNMT1基因的功能以及表达的调控机制提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

用于印记状态分析的20个足月且自然分娩的荷斯坦奶牛的胎盘组织（胎盘1~20）采集于保定当地养牛场，同时采取胎盘对应的母牛外周血液以及用于人工受精的公牛精液用于亲本基因型的鉴定；用于等位基因表达分析的32头成年荷斯坦奶牛（3~4 年）组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑）采集于保定某养牛场。其中胎盘1~3用于全基因组测序、转录组测序和全基因组重亚硫酸盐测序分析，其余17个胎盘（胎盘4~20）用于基于SNP的RT-PCR产物直接测序法分析印记状态。

1.2　试验方法

1.2.1　全基因组测序

使用DNA提取试剂盒（Magen，广州）提取胎盘1~3、及对应的母源血液和父源精子的基因组DNA，微量紫外分光光度计（赛默飞，上海）检测DNA的浓度和纯度，DNA质量合格后，进行全基因组测序。

首先使用Covaris超声破碎仪（Covaris公司，美国）将DNA切割成350 bp大小的片段，利用末端修复反应将DNA片段的末端补齐变为平末端，5′端加入磷酸基团，3′端加入一个腺苷酸“A”，用T4 DNA连接酶将Illumina（Illumina，美国）测序接头连接到DNA片段的两端，使用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒（Beckman coulter，美国）筛选300~400 bp长度的DNA片段构建DNA文库。利用PCR扩增富集DNA文库后，使用qPCR和Agilent 5 400系统（Agilent，美国）对DNA文库进行检验，确保文库的质量。在Illumina平台PE 150（Pair end 150 bp）上进行测序。过滤掉原始测序数据中质量较低的读数后，每个样本的原始数据在 81 000~88 000 M。用BWA软件（参数：mem-t 4-k 32-M）^［16］将有效测序数据与牛的参考基因组APR.2018（ARS-UCD1.2/bosTau9）进行比对，并用SAMTOOLS软件（参数：rmdup）^［15］去除重复数据。SAMTOOLS（-C 50-mpileup-m 2-F 0.002-d 1 000）^［17］用于检测单个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism， SNP）位点。统计SNP数量不少于4个，不高于1 000个，质量值（MQ）不低于20。

1.2.2　转录组测序

使用RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒（天根，北京）提取胎盘1~3的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，微量紫外分光光度计（赛默飞，上海）检测RNA的浓度和纯度，RNA质量合格后，进行转录组测序。

首先用Oligo dT磁珠富集mRNA，随机六聚体引物合成cDNA的第一链，以第一链为模板合成cDNA的第二链。经过末端修复、添加poly-A尾、连接测序接头、选择合适的片段后进行扩增和纯化，构建cDNA文库。利用安捷伦2 100生物分析仪（Agilent 2 100 bioanalyzer）检测文库中的28 S/18 S rRNA比值（>2.0）和插入片段的大小，文库的有效浓度高于1.5 nmol/L符合测序要求。对cDNA文库进行测定，利用fastp^［18］软件对初始reads进行筛选，剔除存在接头、poly-N和低质量的reads，利用HISAT2（版本v2.0.5）软件将得到的reads与牛的参考基因组APR.2018（ARS-UCD1.2/bosTau9）进行比较^［19］。

1.2.3　全基因组重亚硫酸盐测序

胎盘1~3的基因组DNA按照100 ng基因组DNA与0.5 ng未甲基化的内参基因lambda DNA的比例混合均匀，Covaris S220超声破碎仪将基因组DNA打断至200~400 bp大小的片段。用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒（天根，北京）处理后，利用内参基因lambda DNA验证重亚硫酸盐转化效率；经过末端修复与加尾后构建文库。文库质量使用Agilent 5 400系统进行评估，通过qPCR对文库进行定量，浓度＞1.5 nmol/L的文库在Illumina测序平台上进行双端测序。使用FastQC（fastqc_v0.11.8）对raw date评估后用fastp（fastp 0.23.1）软件过滤得到clean date，FastQC评估clean date的质量^［20］。使用Bismark软件（0.24.0版）^［21］将过滤后的reads与参考基因组（_X 700-dovetail）进行比较。

1.2.4　基于SNP的RT-PCR产物直接测序法分析等位基因表达状态

提取另外17个胎盘（胎盘4~20）、母本血液和父本精子，DNA样本，稀释为50 ng/μL终浓度用于PCR扩展。根据NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上牛DNMT1基因的mRNA序列（NM_182651.2），使用Oligo7.0软件（Molecular Biology Insights， USA）在DNMT1基因的内含子35和外显子38设计引物gDNMT1-up和gDNMT1-down（表1）。PCR反应体系为：1 μL DNA模板、上下游引物各0.5 μL、12.5 μL的2×Taq Master Mix（诺唯赞，南京）和10.5 μL的ddH₂O。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸5 min；35个循环；最后为72 ℃延伸5 min。扩增产物利用核酸纯化试剂盒（Magen，广州）回收测序，寻找包括SNP位点（rs211542364 C/T）的杂合子胎盘。设计跨内含子引物cDNMT1-up和cDNMT1-down（表1）扩增杂合子cDNA，扩增反应体系与程序均与扩增DNA相同，扩增产物回收测序分析等位基因表达状态，同时扩增DNMT1基因呈现单等位基因表达胎盘对应的母牛外周血液和公牛精液的DNA，产物测序分析亲本基因型，确定印记状态。

提取32头牛肝脏的基因组DNA，应用与筛选杂合子胎盘相同的方法寻找杂合子牛，提取杂合子牛6个组织的总RNA，RT-PCR产物直接测序分析等位基因表达状态。

1.2.5　亚硫酸盐测序法（Bisulfite Sequencing， BS-Seq）分析甲基化状态

利用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒（天根，北京）处理4个胎盘（DNMT1基因呈现母源等位基因表达和双等位基因表达各2个）的基因组DNA，转化后的DNA于-20 ℃保存。针对UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）数据库中DNMT1基因启动子区CpG：89岛的位置，利用Oligo 7.0软件设计甲基化特异引物（表2）用于巢式PCR扩增。2次PCR扩增产物回收后克隆测序，SnapGene软件（Insightful Science，USA）和Chromas2.4.1软件（Technelysium Pty. Ltd.，Australia）分析每个CpG位点甲基化状态。

2　结果与分析

2.1　WGS和RNA-seq数据联合分析DNMT1基因在牛胎盘中的印记状态

DNMT1基因位于牛的7号染色体，全长43 603 nt。在NCBI数据库中，DNMT1基因有一个mRNA序列（NM_182651.2）和6个预测的剪接体（XM_015471992.3、XM_015471991.3、XM_015471995.3、XM_024993832.2、XM_010806776.4和XM_005208712.5），其中mRNA序列具有40个外显子见图1（a）。首先在胎盘1~3的WGS数据中寻找DNMT1基因外显子上的SNP位点，发现12个SNP位点分别位于DNMT1基因的外显子14、25、29、30、32、34、35、37、38上见图1（b），其中胎盘1、2和3中分别存在0、12、12个SNP位点。分析胎盘2和3的RNA-seq数据，发现胎盘2中的SNP位点处均呈现单等位基因表达，而胎盘3的SNP位点处均呈现双等位基因表达见图2（a）与（b）。分析胎盘2亲本的WGS数据，确定SNP位点处亲本的基因型，发现DNMT1基因在胎盘2中为母源等位基因表达图2（a），表明DNMT1基因在牛胎盘中呈现多态性印记。

2.2　RT-PCR产物直接测序法进一步确定DNMT1基因在牛胎盘中的印记状态

为进一步验证DNMT1基因在牛胎盘中的多态性印记，采用基于SNP的PCR产物直接测序法分析DNMT1基因在17个胎盘（胎盘4~20）中的印记状态。应用位于内含子35和外显子38上的引物gDNMT1-up和gDNMT1-down，扩增966 bp包括SNP（rs211542364）的片段，发现10个包括该SNP位点的杂合子胎盘。应用跨内元引物（cDNMT1-up、cDNMT1-down）进行RT-PCR，扩增产物直接测序分析等位基因表达状态，结果发现DNMT1基因在2个胎盘（胎盘4和5）中为单等位基因表达图3（b），并且为母源等位基因表达；而在另外8个胎盘中为双等位基因表达图3（c），进一步证实DNMT1基因在牛胎盘中为多态性印记。引物位置见图3（a）。

2.3　 DNMT1基因在牛各组织中的等位基因表达

应用基于SNP的RT-PCR产物直接测序法分析DNMT1基因在牛的其他6个组织中的等位基因表达情况，在32头牛中共发现7个包括SNP（rs211542364）位点的杂合子牛，对杂合子牛的组织进行RT-PCR扩增，扩增产物直接测序发现DNMT1基因在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑6个组织中呈现双等位基因表达状态，说明DNMT1基因在成年牛的组织中不印记（图4）。

2.4　 DNMT1基因CpG岛的DNA甲基化状态

在UCSC（http：//genome.ucsc.edu/）数据库中查找DNMT1基因位置的CpG岛，共发现4个CpG岛见图5（a），分别位于DNMT1基因的外显子1（CpG：89）、外显子27（CpG：18）、外显子36（CpG： 18）和外显子37、38（CpG：33）。分析胎盘1~3的WGBS数据，发现4个CpG岛处均不存在差异甲基化区，其中CpG：89为低甲基化状态，其余的3个CpG岛（CpG：18、CpG：18和CpG：33）呈现高甲基化状态见图5（b）。

进一步利用重亚硫酸盐测序法分析位于启动子、外显子1和内含子1处的CpG： 89在另外4个胎盘（胎盘4~7）中的甲基化状态，其中包括2个DNMT1基因呈现母源等位基因表达的胎盘（胎盘4和5）和2个呈现双等位基因表达的胎盘（胎盘6和7）。由于CpG： 89较长（871 bp），分为Region1（包括27个 CpGs）和Region2（包括25个 CpGs）2个区域进行分析。巢氏PCR引物见表2。结果发现在4个胎盘中Region1和Region2均为轻甲基化状态（图6），与WGBS数据的研究结果一致。

3　讨 论

在哺乳动物中一部分基因通过基因组印记这种表观遗传学调控机制而呈现父源等位基因或母源等位基因优先表达^［22］。一些在人和小鼠中被鉴定的印记基因，其在牛中的同源物也逐渐被研究，在过去的10年里，在牛中被鉴定的印记基因由49个^［23］增长到了78个（https：//geneimprint.com自2016—2026年）。印记基因不仅在调控胚胎和胎盘的生长发育，以及出生后的生长中发挥重要作用，一些印记基因还与家畜的经济性状相关^［24-25］。牛不仅是一种重要的经济家畜，还是研究人类胚胎发育^［26］、散在性疾病病因^［27］和复杂性性状的模式生物^［28］，因而丰富牛基因组印记的研究至关重要。

目前，鉴定基因组印记较为成熟的方法是基于SNP的RT-PCR直接测序法，运用此方法研究了牛SGCE/PEG10印记域^［29］，IGF2R/AIR印记域基因^［30］的印记状态。高通量测序技术的发展为研究基因组印记提供了一种新的方式，通过联合WGS、RNA-seq和WGBS数据，更多的印记基因被分析和鉴定^［31］。利用多组学联合测序鉴定印记基因可实现在全基因组层面鉴定印记基因，大大节省了时间，提高了准确率。DNMT1基因编码的DNA甲基转移酶1在维持和稳定生物体的甲基化模式和甲基化水平中发挥作用^［32］。在小鼠中，Dnmt1基因的表达异常会抑制小鼠的早期胚胎发育^［33］。Das等^［14］在筛查人的全基因组范围内等位基因特异性DNA甲基化研究中发现，DNMT1在人类胎盘中表现为母源印记基因。本研究中，联合多组学测序和基于SNP的RT-PCR产物直接测序法分析发现，DNMT1基因在牛不同的胎盘中表现为母源等位基因表达或双等位基因表达，具有个体差异性，呈现胎盘多态性印记。DNMT1基因在人和牛的胎盘中呈现不同的印记状态，提示DNMT1基因在不同类型的胎盘发育中具有不同的调控机制。

DNA甲基化是调控基因组印记的一种重要的表观遗传方式，一些印记基因受来自配子的DNA差异甲基化区调控^［14］，被称为经典的印记基因，经典的印记基因通常在物种间保守。还有一些非经典的印记基因，其表达受DNA差异甲基化区以外的表观遗传修饰调控^［34］，例如组蛋白H3赖氨酸9的二甲基化（H3K9me2）和组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化（H3K27me3）等修饰，其印记表达具有细胞和组织特异性，其中一些表现为胎盘多态性印记^［35］，通常在物种间不保守^［36］。本研究中，牛的DNMT1基因只在部分胎盘中呈现母源等位基因表达，未在其启动子和外显子1和内含子1处的CpG岛上发现差异甲基化区，提示DNMT1基因在牛中是一种非典型的印记基因，其表达可能受到DMR以外的表观遗传修饰所调控，其在牛胎盘中特异的多态性印记调控机制还需进一步研究。

4　结 论

本研究应用多组学测序和基于SNP的RT-PCR产物直接测序法分析了DNMT1基因在牛中的印记状态，结果发现DNMT1基因在牛胎盘中呈多态性印记，并且为母源等位基因表达；而在成年牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑中呈现双等位基因表达。在DNMT1基因位置的CpG岛处未发现DMRs，说明牛DNMT1基因的胎盘多态性印记不受DNA甲基化修饰的调控，是一个非经典的印记基因。本研究结果丰富了牛印记基因的数量，可为进一步研究DNMT1基因的功能和印记的表观调控机制提供参考依据。

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基金资助

河北省农业产业技术体系创新团队项目(HBCT2024240101)

河北省农业产业技术体系创新团队项目(HBCT2024240206)

中央引导地方科技发展资金项目(246Z2914G)