间作对大豆玉米根际微生物与根系代谢物的影响

Effects of intercropping on rhizosphere microorganisms and root metabolites of soybean and maize

摘要

为解析间作模式下大豆和玉米各自根系代谢物与根际微生物的互作关系，设置大豆单作、玉米单作和大豆玉米间作的田间种植模式，在大豆鼓粒期（即玉米抽雄期），通过16S、ITS微生物组和非靶向代谢组高通量检测技术，测定不同种植模式下大豆和玉米各自根际微生物多样性和相对丰度，筛选间作与单作模式下大豆和玉米各自的根系主要差异代谢物，并对根际微生物与根系代谢物间的互作关系进行相关分析。结果表明：1）大豆玉米间作可极显著提高大豆根际细菌的Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数（P<0.01），极显著降低大豆根际慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度（P<0.001）。2）在间作与单作大豆根系中检测到的差异代谢物有534种，其中相对丰度上调的有194种、下调的有340种；在间作与单作玉米根系中检测到的差异代谢物有604种，其中相对丰度上调的有284种，下调的有320种。大豆根系差异代谢物主要富集在氨基酸生物合成、ABC转运蛋白和D-氨基酸代谢等通路；玉米根系的差异代谢物主要富集在次级代谢物生物合成、色氨酸代谢和类黄酮生物合成等通路。3）慢生根瘤菌属相对丰度与大豆根系soyMets Cluster Ⅰ类群中除1-｛［3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基］氧基｝-3，5-二羟基环己烷-1-羧酸外的所有差异代谢物的相对丰度均呈显著正相关（P<0.05），与soyMets Cluster Ⅱ类群中除1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺外的所有差异代谢物的相对丰度呈极显著负相关（P<0.01）。紫霉属（Purpureocillium）、酵母属（Saitozyma）、Badarisama属相对丰度均与玉米根系mazMets Cluster Ⅰ类群中2，3，4-三羟基-4’-乙氧基苯甲酮等差异代谢物的相对丰度均呈显著负相关（P<0.05），与mazMets Cluster Ⅱ类群中苏氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸等差异代谢物的相对丰度均呈显著正相关（P<0.05）。综上，间作可显著提高大豆根际细菌的多样性，降低大豆根际慢生根瘤菌属和镰刀菌属的相对丰度。大豆根际慢生根瘤菌属相对丰度与大豆根系部分差异代谢物相对丰度显著相关，紫霉属、酵母属、Badarisama属相对丰度均与玉米根系部分差异代谢物相对丰度显著相关。

Abstract

To reveal the complex interaction relationship between root metabolites and rhizosphere microorganisms of soybean and maize under intercropping systems， field experiments were established with planting patterns including soybean monoculture， maize monoculture， and soybean and maize intercropping. During grain-filling stage of soybean （corresponding to the tasseling stage of maize）， high-throughput detection technologies including 16S and ITS amplicon and non-targeted metabolomics were employed to analyze the effects of intercropping on the rhizosphere microbial diversity and relative abundance of soybean and maize under different planting patterns. The main differential metabolites in the root of soybean and maize under planting patterns including intercropping and monoculture were screened， and the interaction relationship between rhizosphere microorganisms and root metabolites was analyzed through correlation analysis. The results showed： 1） soybean and maize intercropping significantly increased bacteria α-diversity index including Shannon， Simpson， Chao1 and ACE in soybean rhizosphere （P<0.01）， and reduced relative abundance of Bradyrhizobium and Fusarium in soybean rhizosphere（P<0.001）. 2）A total of 534 differentially expressed metabolites （DEMs） were identified in soybean roots （194 up-regulated and 340 down-regulated） and 604 DEMs in maize roots （284 up-regulated and 320 down-regulated） were identified between intercropping and monocultures. DEMs in soybean root were mainly enriched in pathways such as amino acid biosynthesis， ABC transporters， and D-amino acid metabolism. DEMs in maize root are mainly enriched in pathways such as secondary metabolite biosynthesis， tryptophan metabolism and flavonoid biosynthesis. 3）The relative abundance of Bradyrhizobium was significantly positively correlated （P<0.05） with relative abundance of all DEMs in the soyMets Cluster Ⅰ group except for 1-｛［3-（3，4-dihydroxyphenyl）acryloyl］oxy｝-3，5-dihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid， and showed an extremely significant negative correlation （P<0.01） with relative abundance of all DEMs in the soyMets Cluster Ⅱ group except for 1-palmitoyl-2-（archidonoyl）-sn-glycero-3-phosphoethanolamine in soybean root. The relative abundance of Purpureocillium， Saitozyma and Badarisama showed a significant negative correlations （P<0.05） with the relative abundance of DEMs in the mazMets Cluster Ⅰ group such as 2，3，4-trihydroxy-4-ethoxybenzophenone， showed a significant positive correlation （P<0.05） with relative abundance of DEMs in the mazMets Cluster Ⅱ group such as Thr-Ala-Phe-Lys， in maize root. In conclusion， soybean and maize intercropping significantly increased bacteria diversity in soybean rhizosphere， significantly decreased the relative abundance of Bradyrhizobium and Fusarium in soybean rhizosphere. The relative abundance of Bradyrhizobium in the soybean rhizosphere was significantly related to DEMs in soybean root， while Purpureocillium， Saitozyma and Badarisama in the maize rhizosphere were significantly related to DEMs in maize roots.

Graphical abstract

关键词

间作 / 大豆 / 玉米 / 细菌 / 真菌 / 根系代谢物

Key words

intercropping / soybean / maize / bacteria / fungus / root metabolites

大豆与玉米等高秆作物间、套作是缓解我国大豆种植面积短缺和保障国家粮食安全的有效途径之一^［1］。大豆玉米间作作为“禾豆”间作的经典模式，已被证明可以通过高矮秆搭配互补提高冠层光能截获和热量利用效率^［2］，同时借助地下部根系分泌物和根际微生物功能协同促进作物生长^［3］，最终实现间作系统的总体增产^［4］。然而，已有研究表明，在大豆玉米间作模式中，大豆根系结瘤关键信号分子异黄酮类物质的分泌总量显著下降^［3］，从而影响大豆根瘤的正常形成^［5-6］。此外，禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）作为玉米茎腐病和大豆根腐病的重要致病菌，能够相互侵染2种寄主，具有加重间作模式下这2种病害的潜在风险^［7］。作物地下部分泌物与根际微生物间的互作问题在一定程度上限制了大豆玉米间作系统产量的进一步提升^［8］。根系可以将作物体内代谢物以分泌物的形式分泌至土壤环境中，从而改变作物根际土壤微生物的群落结构^［9］，同时，根际微生物群落结构的改变和特定菌群在根际定殖也可诱导根系代谢物的合成和分泌^［10］。而根系分泌物中的绝大多数物质，都直接来源于根系内部的代谢活动，根系内部代谢物的种类和积累量在一定程度上影响着根系分泌物的代谢^［11-12］。因此，深入研究间作模式下植物-微生物的互作，对于揭示大豆玉米间作产量优势的生物学互作机制具有重要意义。

近年来，国内外学者对间作优势机理的研究多集中于地上部光热资源利用^［2，13］和地下部养分水分互补^［14］等方面。然而，间作模式下作物根系与土壤微生物间的相互作用也是间作优势的重要体现^［15-16］。关于间作模式下大豆、玉米根际微生物群落结构、根系分泌物特征及互作方面的研究已有很多报道。大豆和玉米间作可提高根际土壤微生物的丰富度和多样性指数，改变细菌和真菌群落结构^［17］，可增加有益微生物的比例^［18］，并显著增加根系分泌物的种类和含量^［19］。同时，间作可还通过促进大豆根系分泌物的沉积，从而促进根瘤发育和固氮作用^［20］。此外，根系分泌物化学信号介导的植物-微生物互作一直备受关注。如大豆根系分泌的类黄酮（尤其是染料木素等）在大豆玉米间作模式中作为关键信号分子能够将以往被认为专一共生于豆科植物的慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）引入玉米根际，并在2种作物根系交互区发生特异性富集^［21-22］。可见，根系分泌物在间作模式下植物-微生物的互作过程中发挥着重要作用。而目前关于间作模式下大豆、玉米根系内部代谢物的变化特征及其与根际微生物间的关系的研究尚未见报道。本研究在大豆玉米间作和单作模式下，利用微生物组学（16S、ITS）高通量测序技术分析间作模式下大豆和玉米根际微生物（细菌、真菌）群落的变化特征，通过非靶向代谢组学技术分析大豆和玉米各自在间作模式下根系代谢物的响应特征，筛选主要差异代谢物，分析大豆和玉米各自根系差异代谢物和根际微生物间的相关关系，旨在探明间作对大豆和玉米根际微生物、根系代谢物及其相互关系的影响，以期为更好地利用大豆玉米间作产量优势提供依据。

1　材料与方法

1.1　试验地概况

试验于2024年在广西壮族自治区农业科学院里建科学研究基地（23°14' 49 " N，108°3' 26" E，海拔116 m）进行。试验地点属亚热带季风气候带。作物生育期3—7月内试验地的日最大降雨量56.8 mm，年总降雨量1 573.2 mm，日最高温39 ℃，日最低温9 ℃，月平均日照时数195.8 h。试验地耕层土壤平均有机质含量19.19 g/kg，全氮含量1.65 g/kg，全磷含量1.04 g/kg，全钾含量13.56 g/kg，碱解氮含量73.01 mg/kg，有效磷含量34.88 mg/kg，有效钾含量400.09 mg/kg，土壤pH 6.39。

1.2　材料

玉米（Zea mays L.）品种为‘青青700’，株型半紧凑，株高246 cm，生育期104 d。大豆（Glycine max L.）品种为‘桂春豆108’，具有耐荫性强，抗倒伏等特性。玉米种子购于广西青青农业科技有限公司，大豆种子为本课题组提供。

1.3　田间试验

采用随机区组试验设计，设置大豆单作、玉米单作和大豆玉米间作的田间种植模式，东西行向，每种作物每种种植模式设置6个小区重复，每小区面积为80 m²（8 m×10 m）。单作大豆行距0.40 m，株距0.10 m，留单株。单作玉米行距0.50 m，株距0.30 m，留单株。大豆玉米间作为2行玉米3行大豆，大豆行距0.35 m，株距0.10 m，留单株。玉米行距0.40 m，株距0.35 m，留双株，相邻玉米行和大豆行间距为0.70 m。播种时一次性施复合肥（N、P₂O₅和K₂O含量均为15 g/100 g，总养分≥45 g/100 g） 300 kg/hm²作底肥。大豆和玉米于3月8日同时播种，每穴2~3粒。待出苗后进行人工间苗。期间进行人工除草3次，根据土壤墒情适时适量进行喷灌淋水。

1.4　取样

在大豆鼓粒期（即玉米抽雄期）分别对单作大豆（monoculture soybean，MS）、间作大豆（intercropping soybean，IS）、单作玉米（monoculture maize，MM）和间作玉米（intercropping maize，IM）进行根际土壤和根系取样。每个小区均在大豆和玉米各自行的中间1/2处取样，连续选3株连根拔出，晃动根部，去除根部松散的土壤后，用刷子从根部收集残留的根际土壤，用20目的筛子过筛后分装成2份，液氮速冻后，置于-80 ℃保存，分别用于细菌16S和真菌ITS高通量测序。用pH 7.4的PBS缓冲液将植株根系清洗干净，用吸水纸吸干水分后，用手术刀切取主根中段的侧根组织，装入离心管内，液氮速冻后置于-80 ℃保存，用于检测根系代谢物。

1.5　根际土壤微生物16S及ITS高通量测序分析

根际土壤微生物16S和ITS高通量测序委托武汉迈维代谢生物科技股份有限公司完成。采用改良的CTAB法^［23］提取样本的基因组DNA，使用带Barcode的特异引物分别对细菌16S扩增子序列V₃—V₄区域和真菌扩增子序列ITS2区进行PCR扩增。16S V₃—V₄区扩增引物序列为341F（5’→3’，下同）：barcode-CCTACGGGRBGCASCAG，806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT^［24］。ITS 2区扩增引物序列为ITS3-2024F：barcode-GCATCGATGAAGAACGCAGC，ITS4-2409R：TCCTCCGCTTATTGATATGC^［25］。16S和ITS序列PCR扩增均使用20 μL的混合反应体系，包括15 μL PCR预混液（美国New England Biolabs公司），上游、下游引物各2 μL，DNA模版1 μL。PCR反应条件为：98 ℃预变性1 min，98 ℃变性 10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环，72 ℃ 5 min。使用美国Illumina公司TruSeq^® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，使用美国Illumina公司的NovaSeq 6000高通量测序仪进行上机测序。下机数据经过滤、拼接，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据。运用QIIME 2（v2023.2）^［26］进行降噪分析生成扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）。最后基于SILVA数据库（https：//www.arb-silva.de/）对扩增子进行物种注释。

1.6　根系非靶向代谢物检测及鉴定

委托武汉迈维代谢生物科技股份有限公司通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法进行大豆根系非靶向代谢物检测和鉴定。色谱柱为Waters ACQUITY Premier HSS T3 Column 1.8 µm，2.1 mm × 100 mm。色谱条件：流动相A为0.1%（V/V）甲酸/水；流动相B为0.1%（V/V）甲酸/乙腈。仪器柱温为40 ℃；流速0.4 mL/min；进样量4 μL。质谱数据采集采用信息依赖采集（IDA）模式，使用Analyst TF 1.7.1软件。雾化气50 psi，辅助气50 psi，气帘气25 psi，雾化温度550 ℃；正、负模式下的散簇电压分别为60 V和-60 V，离子喷雾浮压分别为5 000 V和-4 000 V。对各组样本下机原始数据中缺失率>50%的峰进行过滤，校正筛选后的峰通过检索武汉迈维代谢生物科技股份有限公司实验室自建数据库整合公共库和预测库，并采用metDNA方法进行代谢物鉴定。

1.7　数据分析

用Excel 2019进行数据整理，用Origin 2024b进行差异显著性分析（Fisher LSD法、T-检验）和相关图表的绘制；通过迈维生信云平台（https：//cloud.metware.cn）进行微生物组和代谢组数据分析，包括Mantel-test、Spearman相关分析等。通过正交偏最小二乘法判别分析法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）进行代谢物主成分分析。基于OPLS-DA模型得到变量重要性投影值（variable importance in projection，VIP），在VIP>1，差异倍数（fold change，FC）≥2.0和≤0.5的条件下，筛选差异代谢物。

2　结果与分析

2.1　间作对大豆玉米根际微生物群落的影响

2.1.1　根际微生物多样性分析

由图1可知，与单作相比，间作模式下大豆根际土壤细菌种群的Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数均有所升高，均达极显著水平（P<0.01或P<0.001）；而真菌种群的Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数均无显著变化（P>0.05）。与单作相比，间作玉米根际土壤细菌和真菌种群的Shannon、Simpson、Chao1和ACE多样性指数均无显著变化（P>0.05）。可见，间作模式可显著增加大豆根际细菌的多样性，而对大豆根际真菌的多样性无显著影响；间作模式对玉米根际细菌和真菌的多样性均无显著影响。

2.1.2　根际微生物属水平群落结构和相对丰度分析

由图2可知，大豆和玉米根际微生物属水平的相对丰度排名前10的细菌菌群均为慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、蓝细菌门未鉴定菌属（unidentified Cyanobacteria）、红游动菌属（Rhodoplanes）、出芽单胞菌属（Gemmatimonas）、盖亚女神菌属（Gaiella）、硝化螺菌属（Nitrospira）、沙壤土杆菌属（Ramlibacter）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）和小单孢菌属（Micromonospora）。其中，慢生根瘤菌属在大豆根际土壤中占据主导优势，而鞘氨醇单胞菌属则在玉米根际土壤中占据主导优势。与单作相比，间作可极显著降低大豆根际慢生根瘤菌属的相对丰度（P<0.001），显著降低蓝细菌门未鉴定菌属的相对丰度（P<0.05）。

大豆和玉米根际微生物属水平相对丰度排名前10的真菌菌群包括镰刀菌属（Fusarium）、炭疽菌属（Colletotrichum）、Pervertustaceae科未分类菌属（Pervetustaceae unclassified）、Poaceascoma属、Saitozyma属、Badarisama属、罗兹菌门未分类菌属（Rozellomycota unclassfied）、螺旋聚孢霉属（Clonostachys）、半乳菌属（Paracremonium）和紫孢霉属（Purpureocillium）。与单作相比，间作极显著降低了大豆根际镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度（P<0.001）。

2.2　间作对大豆和玉米根系代谢物的影响

2.2.1　差异代谢物筛选

由图3可知，单作和间作模式下，大豆和玉米根系代谢物截然不同，间作大豆和单作大豆（IS vs MS）、间作玉米和单作玉米（IM vs MM）根系代谢物均形成各自独立的聚类簇，置信区间互不重叠且相距较远，这表明IS vs MS、IM vs MM根系代谢物的相对丰度和种类均存在显著差异。

由图4可知，筛选得到大豆（IS vs MS）根系差异代谢物534种，其中相对丰度上调的代谢物有194种、下调的代谢物有340种；筛选到玉米（IM vs MM）根系差异代谢物604种，其中相对丰度上调的代谢物有284种、下调的代谢物有320种。

由表1可知，在Log₂（FC）绝对值排名前20的大豆（IS vs MS）根系差异代谢物中，6种氨基酸及其衍生物的相对丰度在间作模式下均下调，包括脯氨酰-天冬酰胺基-蛋氨酸、酪氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺等；甘油磷脂类中有3种差异代谢物的相对丰度上调，包括N-甲基磷脂酰乙醇胺（15∶0/20∶5）、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和菊苣棕榈酸酯，仅1，2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的相对丰度下调；有机酸3-（4，7-二甲氧基-2H-1，3-苯并二氧基-5-基）丙酸的相对丰度上调，而1-｛［3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基］氧基｝-3，5-二羟基环己烷-1-羧酸的相对丰度下调；脂质溶血磷脂酰胆碱20∶0和溶血磷脂酰胆碱14∶0的相对丰度均下调；苯及其衍生物去甲氧可酮和2’-羟基-5’-甲基苯乙酮的相对丰度均下调。

由表2可知，在Log₂（FC）绝对值排名前20的玉米（IM vs MM）根系差异代谢物中，氨基酸及其衍生物有7种，其中，谷酰氨-酪氨酸-苯丙氨酸、L-蛋氨酸-L-天冬酰胺-L-赖氨酸、L-异亮氨酸-L-缬氨酸、苏氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸和苏氨酸-丙氨酸-缬氨酸-天冬氨酸5种代谢物的相对丰度均上调，甘氨酸-甘氨酸-谷酰胺和S-甲基-L-半胱氨酸的相对丰度均下调；海生菊苷、香叶木素和柚皮素查耳酮3种黄酮类代谢物的相对丰度均下调。大豆和玉米排名前20的根系差异代谢物无重合，这充分体现了大豆和玉米各自适应间作环境的根系代谢的差异。

2.2.2　差异代谢物KEGG通路富集分析

由图5可知，大豆（IS vs MS）根系差异代谢物富集到的显著性（P）排名前10的KEGG通路分别是氨基酸生物合成、D-氨基酸代谢、单菌霉素生物合成、赖氨酸生物合成、精氨酸生物合成、2-氧羧酸代谢、氨酰tRNA生物合成、亚油酸代谢、ABC转运蛋白和苯丙氨酸代谢。共有24种大豆（IS vs MS）根系差异代谢物富集在这10个KEGG通路。氨基酸生物合成、ABC转运蛋白和D-氨基酸代谢为主要通路，其中精氨酸、鸟氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸等13种差异代谢物富集在氨基酸生物合成通路，且在间作模式下其相对丰度均下调。可见，间作模式下大豆根系自身合成氨基酸的能力显著减弱。此外，鸟嘌呤核苷、精氨酸、鸟氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸、L-天冬氨酸、木二糖、α-1，5-L-阿拉伯四糖和α-1，5-L-阿拉伯三糖这10种差异代谢物富集在ABC转运蛋白通路，且在间作模式下其相对丰度均发生下调，其中鸟嘌呤核苷、5-氨基乙酰丙酸、木二糖、α-1，5-L-阿拉伯四糖和α-1，5-L-阿拉伯三糖这5种差异代谢物只富集在ABC转运蛋白通路。可见，间作模式下大豆根系与根际土壤中的氨基酸、糖类等物质交换显著减弱。

玉米（IM vs MM）根系差异代谢物富集到的显著性（P）排名前10的KEGG通路包括色氨酸代谢、类黄酮生物合成、次级代谢物生物合成、异黄酮生物合成、甘油脂代谢、α-亚油酸代谢、亚油酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甜菜红碱生物合成和磷脂酰肌醇信号系统。共有47种玉米（IM vs MM）根系差异代谢物参与了这10个KEGG通路。次级代谢物生物合成、色氨酸代谢和类黄酮生物合成等3个通路为主要通路。菊苣棕榈酸酯、柚皮素、山梗菜碱、樱花素、血清素等39种差异代谢物富集在次级代谢物生物合成通路，黄酮类（23.08%）占比最大，生物碱类（20.51%）次之。其中，菊苣棕榈酸酯、山梗菜碱、血清素、5-氨基咪唑核糖核苷酸和异刺芒柄花素等19种代谢物的相对丰度在间作模式下均上调，柚皮素、樱花素、色胺、柚皮素查耳酮和N-乙酰-5-羟基色胺等20种代谢物的相对丰度在间作模式下均下调。富集在色氨酸代谢通路的6种差异代谢物中，血清素、5-氨基咪唑核糖核苷酸、异刺芒柄花素和2-氨基苯酚的相对丰度在间作模式下均上调，而3-吲哚乙腈和5-羟吲哚丙酮酸的相对丰度在间作模式下均下调。

2.3　根际微生物与根系代谢物关联分析

由图6可知，大豆（IS vs MS）根系差异代谢物2’-羟基-5’-甲基苯乙酮（soyTop-16）、3-（4，7-二甲氧基-2H-1，3-苯并二氧基-5-基）丙酸（soyTop-18）、菊苣棕榈酸酯（soyTop-20）的相对丰度均与大豆根际细菌菌群属水平的相对丰度达极显著相关（P<0.01）；1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（soyTop-19）的相对丰度与大豆根际细菌菌群属水平相对丰度的达显著相关（P<0.05）。

由图7可知，玉米（IM vs MM）根系差异代谢物2，3，4-三羟基-4’-乙氧基苯甲酮（mazTop-2）、海生菊苷（mazTop-4）、S-甲基-L-半胱氨酸（mazTop-5）、4，2’-二羟基查尔酮（mazTop-8）、柚皮素查耳酮（mazTop-9）的相对丰度均与玉米根际真菌菌群属水平的相对丰度存在极显著相关（P<0.01）；甘氨酸-甘氨酸-谷酰胺（mazTop-3）、Nb-p-香豆酰色胺（mazTop-6）、香叶木素（mazTop-7）相对丰度与玉米根际真菌菌群属水平的相对丰度均达显著相关（P<0.05）。

由图8可知，大豆（IS vs MS）根系差异代谢物可聚为2个类群，第1类群（soyMets Cluster Ⅰ）包括脯氨酰-天冬酰胺基-蛋氨酸（soyTop-1）、1-｛［3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基］氧基｝-3，5-二羟基环己烷-1-羧酸（soyTop-2）等15种差异代谢物；第2类群（soyMets Cluster Ⅱ）包括2’-羟基-5’-甲基苯乙酮（soyTop-16）、N-甲基磷脂酰乙醇胺（15∶0/20∶5）（soyTop-17）、3-（4，7-二甲氧基-2H-1，3-苯并二氧基-5-基）丙酸（soyTop-18）、1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（soyTop-19）和菊苣棕榈酸酯（soyTop-20）5种差异代谢物。soyMets Cluster Ⅰ类群均为下调代谢物，且80%以上为含氮代谢物，而soyMets Cluster Ⅱ类群均为上调代谢物。慢生根瘤菌属相对丰度与除1-｛［3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基］氧基｝-3，5-二羟基环己烷-1-羧酸（soyTop-2）外的soyMets Cluster Ⅰ类群的所有差异代谢物的相对丰度均呈显著正相关（P<0.05），与除1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（soyTop-19）外的soyMets Cluster Ⅱ类群的所有差异代谢物的相对丰度均呈极显著负相关（P<0.01）。此外，鞘氨醇单胞菌属、硝化螺菌属、沙壤土杆菌属等菌群的相对丰度也与soyMets Cluster Ⅰ类群的溶血磷脂酰胆碱20∶0（soyTop-4）、脯氨酰-天冬酰胺基-蛋氨酸（soyTop-1）等差异代谢物的相对丰度呈显著负相关（P<0.05），与soyMets Cluster Ⅱ类群的3-（4，7-二甲氧基-2H-1，3-苯并二氧基-5-基）丙酸（soyTop-18）、菊苣棕榈酸酯（soyTop-20）等差异代谢物的相对丰度呈显著正相关（P<0.05）。

玉米（IM vs MM）根系差异代谢物可聚为2个类群，第1类群（mazMets Cluster Ⅰ）包括奥里克辛（mazTop-1）、2，3，4-三羟基-4’-乙氧基苯甲酮（mazTop-2）、甘氨酸-甘氨酸-谷酰胺（mazTop-3）等9种差异代谢物；第2类群（mazMets Cluster Ⅱ）包括苏氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸（mazTop-10）、2，3-双氧-（香叶基）-sn-甘油-1-磷酸-L-丝氨酸（mazTop-11）、2-氨基苯酚（mazTop-12）等11种差异代谢物。紫霉属（Purpureocillium）、酵母属（Saitozyma）和Badarisama属的相对丰度均与mazMets Cluster Ⅰ类群差异代谢物2，3，4-三羟基-4’-乙氧基苯甲酮（mazTop-2）、海生菊苷（mazTop-4）、S-甲基-L-半胱氨酸（mazTop-5）、Nb-p-香豆酰色胺（mazTop-6）、香叶木素（mazTop-7）、4，2’-二羟基查尔酮（mazTop-8）、柚皮素查耳酮（mazTop-9）的相对丰度呈显著负相关（P<0.05），与mazMets Cluster Ⅱ类群差异代谢物苏氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸（mazTop-10）、2-氨基苯酚（mazTop-12）、2，5-二羟基苯乙酮（mazTop-14）、离子霉素（mazTop-15）、L-蛋氨酸-L-天冬酰胺-L-赖氨酸（mazTop-16）、L-异亮氨酸-L-缬氨酸（mazTop-17）和豌豆离子酮葡萄糖苷（mazTop-18）的相对丰度呈显著正相关（P<0.05），见图8（b）。

3　讨 论

禾本科与豆科间作是目前世界范围内应用最广泛、最成功的间作种植经典模式^［27-29］。已有研究普遍认为豆科禾本科间作对根际微生物数量、种群结构和多样性有很大影响^［30-32］。本研究结果表明，大豆玉米间作模式下，大豆根际土壤细菌种群的α多样性指数极显著高于单作（P<0.01），这与大豆玉米间作^{［17，33-34］}、大豆高粱间作^［34］、大豆甘蔗间作^［35］、大豆小麦间作^［36］能提高大豆根际微生物多样性的结果一致。本研究还发现，间作模式下玉米根际土壤细菌和真菌的α多样性均与单作相比无显著变化（图1），这与许代香等^［34］的研究结果一致。慢生根瘤菌属、根瘤菌属等是豆科植物生物固氮的核心菌群^［37］。本研究发现，大豆玉米间作极显著降低了大豆根际土壤中慢生根瘤菌属的相对丰度（P<0.001）（图2），这与陈亚丽等^［17］研究得出的大豆玉米间作可显著降低大豆根际土壤中慢生根瘤菌属的相对丰度（P<0.05）的结果一致。Zhang等^［22］研究发现，大豆根系分泌的类黄酮物质可作为关键信号分子，使慢生根瘤菌富集至玉米的根际，从而促进玉米的生长。也有研究表明，玉米根系分泌的香草酸、对羟基苯甲酸等酚类物质对大豆根瘤菌表现出较强的趋化吸引力^［38］，玉米根系分泌的苯并噁嗪类物质可改变土壤微生物群落结构，并对有益菌群具有一定的抑制作用^［39］。由此推测，大豆和玉米根系分泌物的这种化感作用可能导致了大豆根际慢生根瘤菌属相对丰度的下降。此外，本研究表明，间作模式下大豆根际土壤中一些病原菌如镰刀菌属的相对丰度受到抑制，这与Chang等^［40-41］研究结果一致。镰刀菌是多种作物（包括大豆）根腐病和枯萎病的病原菌^［42］。间作模式下大豆根际镰刀菌等病原菌的减少可使大豆免受土传病害的侵扰，降低根腐病的发病率^［43］，这正是间作优势的充分体现。

根系作为植物与土壤环境直接接触的器官，是感知和响应生长环境变化的前哨^［44］。间作作物根系在共生期内不可避免地会面临由种间互作引起的生长环境变化，包括水分、养分和空间等资源的竞争^［45-46］，根际微生物群落的变化^［17-18］以及由相邻作物根系分泌物引发的化感作用^［21-22］。作物根系感知到生长环境变化时会主动调整其代谢谱，通过合成、积累和分泌特定的代谢物来应对环境变化^［47-48］。本研究发现，间作模式下大豆根系自身合成氨基酸的能力显著减弱，与根际土壤中的氨基酸、糖类等物质交换显著减弱，这可能是由于间作模式下玉米对土壤氮素的竞争加剧，导致大豆根系对土壤氮素的利用处于劣势所致^［49］。本研究发现，有39种玉米根系差异代谢物富集在次生代谢产物生物合成通路，其中黄酮类（23.08%）占比最大，生物碱类（20.51%）次之。黄酮类代谢物是植物-微生物相互作用中最关键的信号分子之一^［21-22］，生物碱（如山梗菜碱）通常是植物抵御生物或非生物逆境胁迫的有效防御物质^［50］。这表明，间作模式下玉米根系通过调控黄酮类和生物碱类物质的合成，强化了玉米在间作模式下的化学防御过程。

植物根系部分代谢物以分泌物的形式分泌至根际土壤中，通过化感作用吸引有益微生物在根际富集从而促进植株生长^{［19，51］}，同时特定的细菌群落定殖于植物根际，会系统性诱导根系代谢物的分泌^［10］。如假单胞菌目（Pseudomonadales）和芽孢杆菌目（Bacillales）微生物在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）根际定殖可诱导根系没食子酸己糖和酰基蔗糖S4：19（6，6，5，2）的分泌，还可以在根系内部系统性诱导阿扎拉酸糖苷的合成和积累^［10］。可见，植物根际微生物影响根系内部代谢物的合成和分泌。本研究发现慢生根瘤菌属相对丰度与大豆根系soyMets Cluster Ⅰ类群代谢物相对丰度呈显著正相关（P<0.05）（图8），且soyMets Cluster Ⅰ类群代谢物在间作模式下的相对丰度均发生了下调（表1），这与本研究前面得出的间作可极显著降低大豆根际慢生根瘤菌属的相对丰度这一结果相互印证。氮素是植物生长发育必须的大量营养元素，慢生根瘤菌属已被证实参与大豆根系结瘤和生物固氮过程^［52］，而在大豆根系soyMets Cluster Ⅰ类群代谢物中，含氮代谢物占80%。此外，KEGG代谢通路富集结果也表明，大豆根系差异代谢物主要富集在氨基酸生物合成、氨基酸代谢等通路（图5）。由此推测，慢生根瘤菌属可能通过影响大豆根系氮代谢来正向调控soyMets Cluster Ⅰ类群代谢物的相对丰度。另外，本研究还发现玉米根际真菌紫霉属、酵母属及Badarisama属等菌群与玉米根系部分差异代谢物的相对丰度存在一定的相关性（图8）。紫霉属部分物种具有拮抗植物病原菌的能力，如抑制玉米小斑病病菌生长，还能杀线虫、刺激作物生长，促进土壤中有害物质分解^［53］；酵母属部分物种可与昆虫^［54］、植物^［55］形成共生关系，也有少数种类可作为病原菌引起植物病害^［56］。因此，本研究发现的以上菌群和玉米根系mazMets Cluster Ⅰ类群、mazMets Cluster Ⅱ类群差异代谢物相对丰度的相关关系将成为下一步研究的重要切入点。

4　结 论

与单作相比，大豆玉米间作可极显著提高大豆根际细菌种群的α多样性指数，显著降低大豆根际慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）和真菌群落镰刀菌属（Fusarium）的相对丰度。间作模式下，大豆根系自身合成氨基酸的能力显著减弱，且与土壤环境间的氨基酸、糖类等物质交换显著减弱；而玉米则通过上调菊苣棕榈酸酯、山梗菜碱等代谢物的合成和下调柚皮素、樱花素等代谢物的合成来适应间作环境。慢生根瘤菌属相对丰度与大豆根系除1-｛［3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酰基］氧基｝-3，5-二羟基环己烷-1-羧酸外的soyMets Cluster Ⅰ类群的所有差异代谢物的相对丰度均呈显著正相关，与除1-棕榈酰基-2-花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺外的soyMets Cluster Ⅱ类群的所有代谢物的相对丰度呈极显著负相关。紫霉属（Purpureocillium）、酵母属（Saitozyma）及Badarisama属的相对丰度均与玉米根系中mazMets Cluster Ⅰ类群的2，3，4-三羟基-4’-乙氧基苯甲酮等差异代谢物的相对丰度呈显著负相关，而与mazMets Cluster Ⅱ类群的苏氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸等差异代谢物的相对丰度呈显著正相关。

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基金资助

国家重点研发计划(2024YFD1201400)

广西科技重大专项(桂科AA23062017)

广西重点研发计划(桂科AB23026107)

广西农业科学院基本科研业务专项(桂农科2025YP049)