基于非靶向代谢组学的韭菜灰霉病防御机制及早期诊断研究

Research on the defense mechanisms and potential early diagnostic biomarkers against gray mold in Chinese chive (Allium tuberosum) based on untargeted metabolomics

摘要

为解决韭菜灰霉病潜伏期难以察觉、早期防控困难的问题，采用非靶向代谢组学技术结合生理生化指标，系统分析了韭菜在接种灰葡萄孢菌后不同阶段的代谢重编程过程。结果表明：韭菜在潜伏期，苯丙烷、黄酮生物合成和鞘脂代谢通路快速激活，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性约为对照2倍、过氧化物酶（POD）活性约为对照4.3倍；中后期酚类和鞘脂代谢持续表达，以维持膜完整性和信号稳态。基于线性支持向量机算法，本研究筛选并验证了由阿魏酰-O-甲基多巴胺、2，4-二羟基苯甲酸和水杨酸的生物标志物组合，在诊断模型中表现出优秀的区分能力（AUC=0.956）。研究结果为灰霉病的早期诊断和精准防控提供了代谢靶点。

Abstract

To address the difficult detection of latent infection and the challenge of early control in Chinese chive gray mold， non-targeted metabolomics combined with physiological and biochemical indicators were employed to systematically analyze the metabolic reprogramming process of Chinese chives at different stages following Botrytis cinerea inoculation. The results indicated that phenylpropanoid biosynthesis， flavonoid biosynthesis， and sphingolipid metabolism pathways were rapidly activated during the latent phase. Phenylalanine ammonia-lyase （PAL） activity was approximately twice that of the control， and peroxidase （POD） activity was approximately 4.3 times that of the control. Phenolic and sphingolipid metabolism remained active in the mid-to-late stages to maintain membrane integrity and signaling homeostasis. Based on the linear support vector machine algorithm， this study identified and validated a biomarker panel consisting of feruloyl-O-methyldopamine， 2，4-dihydroxybenzoic acid， and salicylic acid， which demonstrated exceptional discriminatory performance （AUC=0.956）. The research results provide metabolic targets for the early diagnosis and precise control of gray mold.

Graphical abstract

关键词

韭菜 / 灰霉病 / 非靶向代谢组学 / 苯丙烷代谢 / 鞘脂代谢 / 早期诊断

Key words

Allium tuberosum / gray mold / untargeted metabolomics / phenylpropanoid metabolism / sphingolipid metabolism / early diagnosis

韭菜（Allium tuberosum）以其独特的风味和营养价值而闻名，是东亚地区广泛种植的重要经济作物^［1］。韭菜的生产受到灰霉病的严重威胁，这是一种毁灭性真菌病害，主要由葱鳞葡萄孢（Botrytis squamosa）^［2］和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）^［3］引起。灰葡萄孢菌作为典型的坏死营养型病原菌，通过分泌多种细胞壁降解酶和草酸等毒性代谢产物迅速破坏寄主细胞结构^［4］，诱导组织快速坏死和腐烂，导致韭菜产量大幅下降和品质恶化。灰葡萄孢菌感染存在潜伏期，在出现明显症状之前难以察觉，在条件合适时迅速爆发，使得及时防治变得困难^［5］。在症状显现时，病原菌已深入组织，施药难以彻底清除感染，防控效果受限，无法阻止产量损失^［6］，而且还加剧了抗药性和农药残留问题^［7］。因此，迫切需要解析韭菜在病原菌潜伏期早期的生理和代谢反应，以开发早期诊断工具和精准的防治策略。

植物响应灰霉菌侵染时，通常通过快速激活防御信号、积累次生代谢物和强化抗氧化系统抵御扩展。宿主与灰葡萄孢菌的初始相互作用会引发氧化爆发，其特征是活性氧（ROS）的快速积累，但其过量积累会导致植物细胞发生氧化损伤^［8］。过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等抗氧化酶的特异性激活在维持细胞氧化还原稳态和延缓细胞死亡方面发挥着关键作用^［9］，而细胞死亡本身有利于坏死营养型病原菌的定殖和扩展^［10］。同时，苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷类途径的关键酶，用于启动抗菌次生代谢产物的合成^［11］；而多酚氧化酶（PPO）催化酚类物质氧化成醌类物质^［12］，有助于木质素的形成和细胞壁的强化^［13］。这些酶活性是植物抗病的重要生理指标，但韭菜中这些酶驱动的特征代谢通路和响应仍有待阐明。

近年来，非靶向代谢组学技术已成为解析植物和病原互作复杂代谢重编程的有力工具，能够全面展现调控宿主与病原体相互作用的生理状态和表型生物化学^［14］。在对葡萄^［15］和番茄^［16］等植物的研究中，B. cinerea侵染后体内多种防御相关代谢物显著积累，包括酚类化合物、黄酮类、萜烯类以及挥发性有机物（VOCs）。这些物质不仅具有直接的抗菌活性，还能作为信号分子激活系统获得性抗性（SAR）或诱导邻近细胞的防御反应^［17］。

大多数研究集中于病害高峰期，而关于韭菜从早期侵染潜伏期到后期病害快速扩展阶段动态代谢变化的研究仍较少。揭示病害侵染后植物早期的代谢变化对于筛选能够区分潜伏感染和健康组织的可靠生物标志物至关重要^［18］。本研究拟以韭菜为材料，采用基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学技术，结合抗氧化酶活性测定，旨在解析韭菜在灰霉病菌接种后代谢变化及防御机制，筛选可靠的潜伏期感染生物标志物，以期为韭菜灰霉病的早期代谢变化和防控提供参考。

1　材料与方法

1.1　植物材料及菌株培养

韭菜品种为‘航研998’，韭菜根来自北京市植物保护站种植基地。2024年11月移栽至含草炭和蛭石及正常土壤（体积比1∶1）的种植盆中，在北京市农林科学院人工温室中培养。生长条件为光周期16 h光/8 h暗，温度25 ℃/20 ℃（昼/夜）。

韭菜灰霉病菌B. cinerea来自北京市农林科学院植物保护研究所。病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上25 ℃培养7 d，待菌丝长满培养皿后用于2025年6月进行接种试验。

1.2　试验设计及样本采集

选取生长一致的4周龄韭菜用于接种试验，采用带有菌丝的菌饼穿刺法接种。将韭菜随机分为处理组和对照组。处理组用直径5 mm的带有菌丝的菌饼接种于韭菜叶片中部，对照组接种不含菌丝的无菌PDA琼脂块。接种后置于相对湿度90%、温度20 ℃条件下培养。接种后1、3和5 d进行取样，每组包含6个生物学重复。所有样品采集后立即用液氮速冻，并保存于-80 ℃冰箱备用。

1.3　防御相关酶活性测定

称取0.5 g韭菜叶片样品，加入预冷的磷酸缓冲液（PBS， pH 7.8），并在冰浴条件下研磨成匀浆。离心后取上清液作为粗酶液。使用标准化的商业试剂盒（Solarbio，北京）测定酶活性。POD采用愈创木酚法测定^［19］，CAT通过监测H₂O₂在240 nm处的吸光度下降率测定^［20］，PPO以邻苯二酚为底物测定^［21］，PAL通过测定肉桂酸在290 nm处的吸光度进行检测^［22］。酶活性单位为U/g。

1.4　代谢物提取

样品冻干后研磨成粉，称取100 mg样品置于50 mL离心管中，加入4 mL 75%甲醇提取液（含0.1%甲酸），涡旋2 min使其与样品充分混合，在25 ℃条件下超声15 min，置于低温高速离心机在4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜于2 mL进样小瓶中，即得韭菜提取液。分别从各样品溶液中取等量溶液，混匀，置于液相小瓶中作为质量控制（QC）样品。

1.5　LC-MS/MS分析

代谢物分析采用Agilent 1290 Infinity Ⅱ UHPLC系统联用Agilent 6546 Q-TOF高分辨质谱仪进行，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱程序如下：0~2 min，5%B；2~6 min，20%B；6~21 min，80%B；21~25 min，95%B；25~27 min，95%B；27~27.1 min，5%B；27.1~30 min，5%B；流速0.3 mL/min，柱温设置为40 ℃，进样体积5 μL。

质谱参数设置：采用Dual AJS离子源于正负模式下，全扫描范围为50~1 700 m/z；喷雾电压为3 500 V（正离子）/3 000 V（负离子），干燥气温度为350 ℃，气体流速10 L/min，Nebulizer气压为30 psi。每次进样前插入2个溶剂样品，每6个样品插入1个QC样品，最后采用Auto MS/MS采集模式对QC样品进行5次迭代扫描。

1.6　数据处理及生物信息学分析

原始质谱数据采用MS-DIAL 5.5软件进行峰识别、峰对齐、去噪与代谢物鉴定，将代谢物与Public_experimentspectra、FiehnHILIC、MassBank、GNPS等数据库进行二级碎片结构比对鉴定。处理后的峰面积矩阵进行数据清洗，删去组间缺失值>50%以及QC样品中变异系数（CV）>30%的代谢物，缺失值用原始谱图峰高填充。

处理后的数据在MetaboAnalyst 6.0平台中用原始峰面积总和进行归一化，然后对原始数据进行log₂转化提高数据正态性，再进行数据标准化（Z-score），进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）、热图分析和Biomarker分析。筛选VIP值>1.0，|log₂FC|>1且FDR<0.05的差异代谢物，差异代谢物通过Welch’s t-test秩和检验进行分析。采用线性支持向量机分类方法进行多变量受试者工作特征曲线分析。差异代谢物的聚类由R软件包“Mfuzz”（v2.56.0）进行。对筛选出的显著差异代谢物进行KEGG注释与富集分析。

1.7　统计分析

数据分析使用Excel进行，图表生成使用GraphPad Prism、Origin 2018。统计显著性通过SPSS确定。误差条表示均值的标准误。

2　结果与分析

2.1　韭菜对灰霉菌侵染的生理反应

接种B. cinerea后，韭菜叶片逐渐出现典型的灰霉病症状。接种后1 d，叶面仅出现少量水渍状小斑点，无明显扩展；接种后3 d，病斑扩大并伴随轻微萎蔫；接种后5 d，病斑进一步融合，形成较大坏死区域，叶片局部枯黄（图1（a））。

为评估韭菜对灰霉病菌侵染的生理防御响应，本研究测定了接种后1、3和5 d叶片中CAT、PAL、POD和PPO的活性变化。CAT活性表现出随侵染进展逐渐下降的趋势（图1（b））。接种后1 d处理组与对照无显著差异，3 d处理组低于对照，5 d处理组CAT活性降低至对照的40%。PAL活性在侵染早期和中期显著上调（图1（c）），接种后1 d处理组PAL活性约为对照的2倍，至3 d处理组PAL活性仍显著高于对照，5 d时PAL活性下降至与对照组相当的水平。在整个侵染过程中，POD活性均表现出显著上调（图1（d）），接种后1 d处理组POD活性约为对照的4.3倍，3 d进一步升高至约4.6倍，5 d仍维持较高水平。PPO活性呈现侵染中期至后期显著诱导的模式（图1（e）），接种后1 d处理组与对照无显著差异，3 d处理组显著升高至对照的近2倍，5 d处理组持续显著高于对照。PAL、POD和PPO活性在B. cinerea侵染过程中被显著诱导，尤其PAL和POD在早期至中期显著上调，而CAT活性在中后期受到抑制，表明韭菜通过差异化调控抗氧化酶系统来应对灰霉病胁迫。

2.2　质量控制及整体代谢轮廓

基于LC-MS/MS非靶向代谢组学分析，在正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下进行代谢物鉴定和分类。共成功鉴定并注释了950种代谢物，其中正离子模式下鉴定出700种，负离子模式下鉴定出250种。为了解韭菜反应的化学物质多样性，对鉴定出的代谢物进行了分类（图2（a））。这些代谢物根据SuperClass水平分类，主要包括脂质及脂类类似物（Lipids and lipid-like molecules，250个，占26.37%）、苯丙烷类及多酮类（Phenylpropanoids and polyketides，152个，占16.03%）、有机酸及其衍生物（Organic acids and derivatives，151个，占15.93%）、有机杂环化合物（Organoheterocyclic compounds，133个，占14.03%）、有机氧化合物（Organic oxygen compounds，91个，占9.60%）等。苯丙烷类及多酮类化合物占比突出，提示韭菜叶片中次生代谢物丰富，与葱属植物固有的防御特性相关。此外，苯环类化合物（Benzenoids）占8.44%（80个），木质素、新木质素及相关化合物（Lignans，neolignans and related compounds）占2.00%（19个），而这些化合物在植物抗病响应中常发挥重要作用。

为评估数据质量和样本整体代谢差异，对36个生物学样本及所有QC样本进行主成分分析（PCA）（图2（b））。PCA得分图显示，第一主成分（PC1）解释了40.2%的变异，第二主成分（PC2）解释了14.1%的变异。QC样本紧密聚集于图中心，表明仪器分析稳定性高、数据重现性良好。空白对照组分布于PC1负轴区域，聚类相对紧密。接种组样本沿PC1正轴方向逐步分离，接种后1 d的样本与对照组聚类较近，表明侵染早期韭菜代谢扰动较轻微；接种后3 d向正PC1轴正方向偏移，与对照分离更明显；接种后5 d分离程度最大，样本点分布于最右侧。该结果表明B. cinerea侵染诱导的代谢重编程呈现明显时间变化，随侵染进程加深，整体代谢轮廓差异逐渐放大。

2.3　差异代谢物筛选

为有效地剔除与研究无关的影响从而筛选差异代谢物，采用有监督的OPLS-DA多元统计分析方法。OPLS-DA得分图显示，所有比较组组间均实现了完美分离（图3（a））。R²X和R²Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q²表示模型的预测能力，所有模型的R²Y和Q²值均接近于1.0（图3（b）），表明模型具有出色的拟合度和预测能力。为了检验模型的可靠性、避免过拟合，进行了200次置换检验。结果显示，模型均未出现过拟合，可用于筛选差异代谢物。基于OPLS-DA模型，结合VIP>1.0，倍数变化FC>2或FC<0.5以及FDR<0.05为标准来筛选显著差异代谢物。火山图直观地展示了各比较组中代谢物的上调与下调情况（图3（c））。随侵染进程推进，显著差异代谢物数量显著增加。接种后1 d共有143个显著差异代谢物，其中上调123个，下调20个；第3天增至255个，其中上调173个，下调82个；第5天增至373个，其中上调174个，下调199个。

2.4　差异代谢物的动态变化及聚类分析

为揭示B. cinerea侵染不同阶段差异代谢物的共有性与特异性特征，以及整体时序表达模式，本研究首先对3个时间点的差异代谢物进行Venn图分析（图4（a））。结果显示，3个比较组共有显著差异代谢物85个，主要包括水杨酸、槲皮素及其糖苷、酚酸类、鞘脂类和苯丙烷衍生物等防御相关化合物，表明其在侵染全程持续参与核心响应。

对这85个共有差异代谢物进行层次聚类分析，以标准化相对含量绘制热图可视化核心差异代谢物的表达模式（图4（c））。大多数核心代谢物在侵染后显著上调，包括早期上调的黄酮类和酚酸类，以及中后期持续积累的鞘脂类和部分苯丙烷衍生物。小部分代谢物渐进下调，主要为有机酸类。

为进一步揭示B. cinerea侵染过程中差异代谢物的时序表达模式，利用Mfuzz算法对所有差异代谢物进行了时序聚类分析（图4（b））。聚类结果将差异代谢物分为6簇，各簇呈现明显的时序动态特征。簇1呈现先升后降模式，代谢物在接种后3 d达到峰值，接种后5 d显著下降。该簇富含关键鞘脂中间体和苯丙素衍生物，如鞘氨醇（Sphinganine）、橙皮素（Hesperetin）、愈创木脂素（Guaiacin）等。簇2表现为渐进上调模式，代谢物从接种后1~5 d持续积累。该簇包括反式肉桂酸（trans-Cinnamic acid）、脱落酸（Abscisic acid）、茉莉酸（Jasmonic acid）、辛二酸（Sebacate acid）等。簇3早期显著上调后快速下降，峰值出现在接种后1 d。如植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、乌头酸（Aconitic Acid）等。簇4渐进下调，接种后5 d降至最低。该簇代谢物主要涉及氨基酸衍生物和有机酸类，如L-丝氨酸（L-Serine）、富马酸（Fumaric acid）等。簇5早期上调后在中后期显著下降，峰值在接种后1 d。该簇富含酚酸类化合物，如槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、对香豆酸（p-Coumaric acid）、反式咖啡酸（trans-Caffeic acid）、水杨酸（Salicylic acid）等。簇6后期显著上调，接种后5 d达到峰值。该簇包括阿魏酰酪胺（Feruloyltyramine）、溶血磷脂（Lysophospholipids）、色胺（Tryptamine）等。

2.5　KEGG通路富集分析及关键代谢通路

为探讨B. cinerea侵染不同阶段差异代谢物的功能意义，本研究对各时间点显著差异代谢物进行KEGG通路富集分析（图5）。在接种后1 d，多个次生代谢和信号相关通路显著富集，包括鞘脂代谢（Sphingolipid metabolism）、泛醌及其他萜类醌生物合成（Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis）、苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、黄酮生物合成（Flavonoid biosynthesis）和植物激素信号转导（Plant hormone signal transduction）等。接种后3 d，黄酮生物合成和鞘脂代谢仍显著，伴随苯丙氨酸代谢（Phenylalanine metabolism）、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）等出现。接种后5 d，鞘脂代谢富集最为突出，同时嘌呤代谢（Purine metabolism）、核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、赖氨酸降解（Lysine degradation）持续表达。

为直观展示核心防御通路的代谢物动态变化，本研究基于KEGG数据库对苯丙烷生物合成、黄酮生物合成、水杨酸分支及鞘脂代谢等关键通路进行绘制（图6）。初始前体L-苯丙氨酸逐渐积累并在接种后3 d达到峰值。p-香豆酸、阿魏酸和芥子酸在侵染前期积累较高，随后下降。水杨酸分支早期显著上调，中期向糖苷形式转化。黄酮分支以槲皮素及其葱属特征糖苷（如槲皮素-3，4'-二葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、芦丁）为主，同样呈现早期峰值，后期下降。鞘脂通路显示持续激活，前体L-丝氨酸被消耗，鞘氨醇和植物鞘氨醇显示阶段性积累，前者中期较高，后者早期突出。

2.6　灰霉病侵染早期潜在生物标志物筛选

为挖掘韭菜灰霉病侵染早期的潜在诊断标志物，本研究基于接种后1 d与对照组的OPLS-DA模型，对差异代谢物进行VIP值排序，筛选VIP值排名前10的候选物作为早期响应标志物（图7（a））。这些代谢物主要包括苯丙烷衍生物（如阿魏酰-O-甲基多巴胺、香豆酰酪胺）、酚酸类（如2，4-二羟基苯甲酸、水杨酸）、鞘脂类（如鞘氨醇、植物鞘氨醇）等。

为进一步评估这些候选物的分类潜力，选取VIP排名前三的代谢物阿魏酰-O-甲基多巴胺、2，4-二羟基苯甲酸和水杨酸在全数据集（36个样本）上构建线性支持向量机（SVM）模型。ROC曲线分析显示，该模型曲线下面积（AUC）为0.956（95%置信区间0.861~1.000），模型的敏感性为94.44%，特异度为88.89%，表明具有较高的分类性能（图7（b））。预测概率分析进一步证实模型对侵染组与对照组的区分能力强（图7（c）），分类时采用0.5的阈值，侵染组与对照组之间界限分明。

对VIP前10的代谢物进行层次聚类分析，以标准化相对含量绘制的热图展示了明显的时序和组别模式（图7（d））。样本按侵染时间和处理清晰分离：对照组聚类紧密，接种组从接种后1~5 d逐步偏移。多数候选代谢物在接种后1 d高表达（如阿魏酰-O-甲基多巴胺、2，4-二羟基苯甲酸、水杨酸），随后在3~5 d下降或维持，反映早期快速诱导特征。

3　讨 论

3.1　韭菜灰霉病症状变化与抗氧化酶系统的防御响应

本研究在接种B. cinerea后，韭菜叶片呈现灰霉病症状，接种1 d后少量叶片开始出现斑点，3 d病斑扩大伴随部分叶片变黄萎蔫，5 d大面积水渍状坏死。侵染后早期潜伏，发病条件合适时叶片快速坏死，和Kapetas等^［5］研究结果一致。灰霉病菌侵染后，抗氧化酶活性变化揭示了韭菜的生理防御策略。PAL、POD和PPO活性在侵染早期至中期显著上调。PAL在接种后1~3 d活性增加，其是植物体内苯丙烷代谢途径中的关键限速酶，在植物抗病防御反应中发挥着核心调控作用。PAL催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，从而启动一系列的生物合成过程，包括木质素、黄酮类化合物、异黄酮、香豆素以及植物抗毒素等，构成植物抵御病原微生物侵袭的重要化学屏障^［23］。POD作为植物体内重要的抗氧化酶，主要功能是催化过氧化氢与酚类、胺类等还原性底物发生氧化还原反应，从而清除细胞内过量积累的活性氧。POD持续高表达，表明韭菜在被侵染后维持活性氧的稳态，同时还参与木质素生物合成、细胞壁形成^［24］，阻止灰霉病菌的侵染。PPO的主要生化功能是催化单酚的邻羟基化和邻二酚的氧化生成邻醌，进一步聚合形成棕色色素，发生褐变^［25］。CAT是清除H₂O₂的关键酶，CAT活性在中后期下降，可能有助于维持H₂O₂作为信号分子^［26］。韭菜在受到灰霉病菌侵染后抗氧化和酚类合成代谢被显著激活，细胞壁加固防御灰霉病菌侵染，这与Ma等^［27］在葡萄响应灰霉病研究结果一致。

3.2　灰霉病侵染核心代谢通路变化

苯丙烷生物合成通路在本研究中居于核心地位。通路映射显示，p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等酚酸在接种后1 d相对积累最高，与PAL活性同步诱导一致。这些化合物可作为木质素前体强化细胞壁，通过物理加固细胞壁来阻断真菌的穿透，或转化为抗菌酚类^［28］。水杨酸及其结合形式水杨酸葡萄糖苷在植物响应病原体侵染中发挥着核心作用，是植物防御反应的关键信号分子^［29］。接种后1 d游离水杨酸的瞬时爆发作为快速警报信号触发系统获得性抗性^［30］。在接种后3 d水杨酸糖基化为水杨酸葡萄糖苷确保了活性激素暂时地储存^［31］，使植物能够维持持续的抗性。

黄酮生物合成分支以槲皮素及其葱属特征糖苷为主，在侵染早期显著表达。槲皮素在植物抗病代谢中扮演着关键角色，主要通过增强抗氧化防御、调节植物免疫信号通路、直接抑制病原菌生长以及参与结构防御等多种机制来提高植物对病原体的抵抗力^［32］。同时槲皮素也能增加植物中水杨酸的生物合成来诱导病原体抗性^［33］。葱属植物中，槲皮素-3，4'-二葡萄糖苷和槲皮素-4'-O-葡萄糖苷是2种重要的黄酮醇糖苷，在葱属植物中含量丰富^［34］，表现出极强的抗氧化活性，有助于保护植物细胞免受氧化损伤，增强植物的整体健康状况和抗病能力^［35］。槲皮素及其糖苷在接种后1 d显著表达，表明韭菜在受到侵染后迅速响应来应对灰霉病胁迫。

在鞘脂代谢中，鞘氨醇和植物鞘氨醇在侵染全过程中显著表达。鞘脂不仅作为细胞膜的结构成分维持膜完整性，还扮演着重要的信号传导和调控角色^［36］。鞘脂是质膜的结构成分和程序性细胞死亡（PCD）的关键调节因子^［37］，灰葡萄孢菌分泌细胞壁降解酶和毒素以破坏宿主膜，鞘脂生物合成的增强可能反映了韭菜修复膜损伤和调节PCD通路以限制病斑扩展。

3.3　生物标志物筛选

在潜伏期检测出灰霉病菌感染对于有效的病害管理至关重要，本研究基于接种后1 d与对照组OPLS-DA分析的VIP排序筛选早期候选标志物：阿魏酰-O-甲基多巴胺、2，4-二羟基苯甲酸和水杨酸。然后利用线性支持向量机算法建立诊断模型，模型准确率91.7%，模型曲线下面积为0.956，95%置信区间为0.861~1.000，模型的敏感性为94.44%，特异度为88.89%，表明模型具有高敏感性和可靠性。

阿魏酰-O-甲基多巴胺是一种天然存在的酰胺类化合物，由阿魏酸和甲基化多巴胺衍生物结合形成。在POD的催化下，酚酰胺能与细胞壁中的半纤维素、果胶等多糖或木质素单体发生氧化偶联，从而提高细胞壁的机械强度和疏水性，使其难以被病原真菌分泌的细胞壁降解酶降解，物理阻断菌丝的穿透。Reem等^［38］研究表明，拟南芥植株内单体阿魏酸含量减少会导致细胞壁相关延伸蛋白含量减少，增加了对灰葡萄孢菌的敏感性。除此以外，阿魏酰-O-甲基多巴胺本身也能够抑制真菌孢子萌发和菌丝生长^［39］。水杨酸是植物针对活体营养型和半活体营养型病原菌的核心信号分子，主要通过激活系统获得性抗性和病程相关蛋白发挥作用^［40］。植物抵御灰葡萄孢菌等典型的死体营养型病原真菌主要依赖茉莉酸和乙烯信号通路^［41］。水杨酸和茉莉酸在植物体内相互拮抗^［42］。El Oirdi等^［43］研究表明，灰葡萄孢菌可通过分泌胞外多糖诱导宿主水杨酸积累，进而激活NPR1抑制茉莉酸通路。水杨酸的积累还会抑制植物CAT2酶活性，阻断CAT2与茉莉酸生物合成酶ACX2/ACX3的相互作用，导致茉莉酸合成受阻，使植物表现出更高的感病性^［44］。本试验中，水杨酸在接种潜伏期迅速积累，反映了韭菜对早期侵染信号的快速响应。2，4-二羟基苯甲酸与水杨酸结构相似，都来源于苯甲酸的羟基化^［45］。Lu等^［46］研究表明，2，4-二羟基苯甲酸作为新型水杨酸衍生物，在茶树真菌侵染中具有正向调控作用。这些化合物多源于苯丙烷和鞘脂途径，在侵染早期进行高表达便于开发快速检测工具用于韭菜灰霉病的早期诊断，同时也可以作为抗性育种分子靶点。

4　结 论

本研究通过基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学结合多时间点设计和抗氧化酶活性测定，系统揭示了韭菜响应灰葡萄孢菌侵染的动态代谢重编程机制。在侵染潜伏期韭菜以苯丙烷生物合成和黄酮生物合成通路快速激活为主，伴随PAL、POD活性上调，水杨酸和酚酸类化合物积累，应对初始渗透胁迫。随着侵染进行，代谢重心显著向鞘脂代谢和SA糖基化转移，以维持膜完整性和信号稳态。此外，基于线性支持向量机机器学习算法和侵染潜伏期的正交偏最小二乘分析，筛选并验证了阿魏酰-O-甲基多巴胺、2，4-二羟基苯甲酸和水杨酸作为早期诊断的核心标志物组合，该模型表现出优秀的区分能力（AUC=0.956）。本研究不仅深化了对葱属植物与死体营养型病原菌互作机制的理解，更为灰霉病的早期田间预警和抗病种质资源的筛选提供了精准的代谢靶点。

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基金资助

平顶山重大科技专项(2020ZD19)

北京市农业农村局财政专项项目(11000026T000003676513)