牛骨骼肌细胞-肌内脂肪细胞互作中关键circRNAs筛选及ceRNA网络解析

Screening of key circRNAs and analysis of the ceRNA network in the interaction between bovine skeletal muscle cells and intramuscular adipocytes

摘要

为探究共培养环境下牛骨骼肌细胞对肌内脂肪细胞中环状RNA（circular RNA，circRNA）表达谱的影响，并揭示circRNA在肌内脂肪沉积中的潜在调控机制，本研究构建了牛骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞Transwell共培养模型。同时，以单独培养的肌内脂肪细胞为对照组，与骨骼肌细胞共培养的肌内脂肪细胞为试验组进行了circRNA测序。采用edgeR软件进行差异表达分析，以|log₂FC|≥1，P<0.05为阈值筛选差异表达的circRNAs，并对其来源基因进行GO和KEGG富集分析。使用OmicShare在线平台构建circRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，进一步筛选关键调控因子。结果表明：1）共鉴定出10 081个circRNAs，其中对照组特有3 881个，共培养组特有3 465个，两组共有2 735个。2）共筛选到51个差异表达的circRNAs，与对照组相比，共培养组中上调表达16个，下调表达35个。3）差异表达的circRNAs来源基因主要富集于组蛋白甲基转移酶活性等GO条目及ECM-受体相互作用等信号通路中。4）共鉴定出42个潜在的ceRNA调控关系对，其中novel_circ_002953处于网络核心位置。 5）Novel_circ_002953可通过吸附novel-m0002-3p，影响PSAP和DHCR24等成脂分化相关基因的表达。Novel_circ_002953和novel_circ_006185可通过吸附novel-m0108-3p调控脂质代谢关键基因WNT5A和ZBTB16等的表达。综上，共培养环境可改变牛肌内脂肪细胞circRNA表达谱。本研究为解析骨骼肌-脂肪互作调控网络提供了新的候选circRNA分子。

Abstract

To investigate the effect of bovine skeletal muscle cells on the circular RNA （circRNA） expression profile in intramuscular adipocytes under co-culture conditions， and to elucidate the potential regulatory mechanisms of circRNA in intramuscular fat deposition， this study established a Transwell co-culture model of bovine skeletal muscle cells and intramuscular adipocytes. Meanwhile， circRNA sequencing was performed on intramuscular adipocytes cultured separately as the control group and those co-cultured with skeletal muscle cells as the experimental group. Differential expression analysis was conducted using edgeR software， with a threshold of |log₂FC|≥1 andP<0.05 to identify differentially expressed circRNAs. GO and KEGG enrichment analyses were performed for the host genes of these circRNAs. A circRNA-miRNA-mRNA ceRNA regulatory network was constructed using the OmicShare online platform to further screen key regulatory factors. The results showed that： 1） A total of 10 081 circRNAs were identified， including 3 881 unique to the control group， 3 465 unique to the co-culture group， and 2 735 shared by both groups. 2） A total of 51 differentially expressed circRNAs were identified， including 16 upregulated and 35 downregulated in the co-culture group compared to the control group. 3） The differentially expressed circRNAs derived genes were mainly enriched in GO terms such as histone methyltransferase activity and signaling pathways such as ECM-receptor interaction. 4） A total of 42 potential ceRNA regulatory pairs were identified， with novel_circ_002953 occupying a central position in the network. 5） Novel_circ_002953 may affect the expression of adipogenic differentiation-related genes such as PSAP and DHCR24 by sponging novel-m0002-3p. Novel_circ_002953 and novel_circ_006185 may regulate the expression of lipid metabolism key genes， including WNT5A and ZBTB16， by sponging novel-m0108-3p. In summary， the co-culture environment can alter the circRNA expression profile of bovine intramuscular adipocytes. This study provides novel candidate circRNA molecules for dissecting the skeletal muscle-adipose interaction regulatory network.

Graphical abstract

关键词

牛 / 肌内脂肪细胞 / 骨骼肌细胞 / 共培养 / circRNA / ceRNA网络

Key words

bovine / intramuscular adipocytes / skeletal muscle cells / co-culture / circRNA / ceRNA network

牛肉作为富含优质蛋白质及血红素铁、锌、维生素B₁₂等人体极易吸收的关键微量元素的重要食物来源，在优化人类营养结构、预防微量元素缺乏和维持生命周期健康方面具有不可替代的地位^［1］。肌内脂肪含量是评价牛肉品质的“金标准”，其沉积过程具有高度复杂性，且依赖于动态的三维调控网络^［2-3］。肌肉组织的主要构成单元骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞在发育过程中形成的独特竞争性微环境稳态平衡可直接影响肌内脂肪的沉积效率^［4］。这种肌肉和脂肪之间通过分泌因子进行交叉“对话”的方式，也被称为“肌-脂互作轴”^［5］。

环状RNA（Circular RNA，circRNA）是一类具有共价闭合环状结构、高度保守且稳定性强的内源性非编码RNA，其主要作为微小RNA（microRNA，miRNA）海绵（ceRNA机制）在细胞质中发挥转录后调控作用^［6］。研究表明，circRNA在癌症治疗^［7-8］、神经发育^［9-10］、肌肉发育^［11-12］和脂肪生成^［13-14］等过程中发挥重要作用。近年来，circRNA在调控脂肪沉积中的作用机制研究取得了重要进展，其调控方式呈现出多样化的特征。部分circRNA通过经典的竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）机制参与脂肪生成调控。例如，近期研究发现m⁶A甲基化修饰的circCDK14在RNA结合蛋白SRSF3和hnRNP A1的协同作用下从细胞核输出至细胞质，通过吸附miR-4492-z来促进牦牛肌内前脂肪细胞的增殖并抑制其分化，进而调控肌内脂肪的沉积^［6］。CircVPS13C可通过miR-5606-X-ECHDC3轴促进牦牛肌肉内脂肪生成^［15］。此外，超增强子相关circRHOQ可通过调节miR-5093/IRF5轴来调节肌内脂肪沉积^［16］。除ceRNA机制外，部分circRNA还可通过编码多肽或与其他调控元件互作的方式发挥功能。circANKRD17可通过其编码的新型蛋白激活PPAR通路，从而促进脂肪细胞分化、脂肪酸代谢和脂滴形成，最终调控肌内脂肪沉积^［17］。然而，现有研究多聚焦于单一细胞类型中的circRNA功能解析。在骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞互作背景下，circRNA的表达变化及其调控网络尚缺乏系统研究。

本研究基于课题组前期建立的牛骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞共培养模型，通过circRNA测序分析了共培养条件下肌内脂肪细胞中circRNA的表达谱变化，筛选差异表达的circRNAs并对其来源基因进行功能富集分析，进一步结合miRNA和mRNA表达数据构建ceRNA调控网络，旨在揭示circRNA介导的肌内脂肪沉积分子机制，为牛肉品质遗传改良提供理论基础和候选分子标记。

1　材料与方法

1.1　试验材料

胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、马血清、杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）和胰酶等细胞培养试剂均购自Invitrogen公司（CA，USA）；胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、罗格列酮和地塞米松均购自Sigma-Aldrich公司（St. Louis，USA）；TRIzol和Prime Script™ RT reagent Kit with gDNA Eraser购自Takara公司（Kyoto，Japan）；2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq购自Mei5bio公司（北京）；氯仿、异丙醇和无水乙醇等均购自广州化学试剂厂；Transwell细胞培养小室（0.4 μm孔径；PET膜）购自广州洁特生物过滤股份有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；本研究所使用的牛骨骼肌细胞与肌内前脂肪细胞由宁夏反刍动物分子细胞育种重点实验室所提供；本研究生成的转录组测序（RNA Sequencing，RNA-seq）数据可在NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1227253）中获取。

1.2　试验方法

1.2.1　牛骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞共培养模型的构建

牛骨骼肌细胞与肌内脂肪细胞共培养模型的建立参考了本课题组前期构建的方法^［18］。具体操作步骤如下：首先，将牛肌内前脂肪细胞接种于Transwell小室（上室），使用含10% FBS的DMEM培养基作为生长培养基，置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中进行培养。待细胞生长至完全汇合（细胞密度达100%）后，将培养基更换为含10% FBS、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/mL胰岛素、1 μmol/L罗格列酮和1 μmol/L地塞米松的DMEM成脂分化培养基，以诱导其向成熟脂肪细胞分化。诱导2 d后更换为含5% FBS、10 μg/mL胰岛素和1 μmol/L罗格列酮的DMEM维持培养基。同时，将牛骨骼肌细胞接种于Transwell下室，使用生长培养基进行培养。待细胞汇合度达80%左右时更换为含2%马血清的DMEM成肌分化培养基进行培养。待脂肪细胞和骨骼肌细胞均诱导分化至第4 天时，将含有脂肪细胞的小室转移至接种有骨骼肌细胞的下室中进行共培养。共培养阶段采用含5% FBS的DMEM培养基维持细胞生长，持续培养4 d后，收集细胞用于后续试验。

1.2.2　RNA-seq

分别收集单一培养（control组）和与牛骨骼肌细胞共培养的肌内脂肪细胞（co-culture组），使用TRIzol法提取其RNA（n=3）。总RNA用Nanodrop 2000微量分光光度计检测RNA纯度（OD260/280比值控制在1.8~2.0），并利用Agilent 2100生物分析仪评估RNA完整性（RIN≥7.0）。取5 μg总RNA，使用Ribo-off rRNA Depletion Kit去除核糖体RNA后，加入RNase R于37 ℃消化15 min以去除线性RNA分子，从而实现circRNA的富集。富集后的RNA利用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep Kit进行cDNA第一链与第二链合成、接头连接及产物纯化，随后进行PCR扩增和纯化。构建完成的文库采用Agilent High Sensitivity DNA Kit进行文库质检，并使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System定量后，于Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。

1.2.3　差异表达circRNAs的筛选

测序下机的原始数据用fastp（Version：0.18.0）进行质控过滤，去除含有接头序列的reads及低质量碱基，获得高质量clean reads。将clean reads比对至核糖体RNA（Ribosomal RNA，rRNA）数据库，去除rRNA污染的reads后，采用HISAT2（Version：2.1.1）软件将剩余reads比对至参考基因组（ARS-UCD1.2）。基于比对结果，使用CIRIquant软件进行circRNA的鉴定与定量。利用R（http：//www.r-project.org/）开展主成分分析（Principal component analysis，PCA）。采用edgeR软件包（Version：3.12.1）对筛选后的circRNA进行差异表达分析，以|log₂FC|≥1且P<0.05作为显著性差异表达的筛选阈值，识别单一培养与共培养牛肌内脂肪细胞两组间差异表达的circRNAs。

1.2.4　实时荧光定量PCR验证测序结果的准确性

为了验证测序数据的可靠性，随机选取若干差异表达的circRNAs进行逆转录-实时荧光定量PCR（Reverse transcription-real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）验证。具体而言，分别提取单一培养与共培养条件下牛肌内脂肪细胞的总RNA，并使用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser去除基因组DNA污染后，反转录合成cDNA。随后，以cDNA为模板，采用2× M5 HiPer SYBR Premix EsTaq配制荧光定量PCR反应体系，在CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪上进行扩增检测。每个样品设置3个技术重复，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）为内参基因进行标准化。通过比较RT-qPCR检测结果与测序获得的circRNA表达趋势，分析两者之间的一致性，从而验证测序数据的准确性与可靠性。

1.2.5　差异表达的circRNAs的功能富集分析

将差异表达circRNAs的来源基因映射至Gene Ontology数据库，采用超几何检验计算显著性，以P<0.05为阈值筛选显著富集的基因本体论（Gene Ontology，GO）terms，从生物过程、细胞组分和分子功能3个层面解析来源基因的功能特征。同时，将来源基因映射至京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，识别显著富集的代谢通路和信号转导通路，以揭示差异表达的circRNA来源基因所参与的主要信号通路。

1.2.6　关键circRNAs的筛选和ceRNA网络的构建

结合差异表达倍数、表达丰度及功能富集分析结果，筛选与生物学过程密切相关的关键circRNAs。采用Miranda（Version：3.3a）、TargetScan（Version：7.0）和RNAhybird进行miRNA靶点预测。使用OmicShare在线平台构建circRNA-miRNA-mRNA相互作用调控网络，阈值为相关系数≥0.9且P<0.05。

1.2.7　数据分析及可视化

CircRNA的差异分析、功能分析及ceRNA网络的可视化均借助OmicShare在线平台上进行^［19］。以GAPDH为内参基因，采用2^-ΔΔCt计算相对circRNA表达水平^［20］。RT-qPCR的结果以均值±标准差（Mean±SD）表示，使用GraphPad Prism 8.0软件进行Student's t检验分析两组间表达差异的显著性，并绘制柱状图。

2　结果与分析

2.1　测序数据质量评估及circRNA鉴定

本研究对control组和co-culture组的样品进行了circRNA测序。原始数据经质控后共获得约5.64亿条clean reads。各样品过滤后的Q20和Q30均在90%以上（Q20：97.90%~98.15%；Q30：93.54%~94.30%），说明测序数据可靠。进一步评估了数据利用率，结果显示（表2），各样品rRNA去除效果良好（Mapped_Reads：0.29%~1.05%）。基因组reads比对结果发现，比对上的reads主要分布于外显子区（51.86%~57.67%），其次为内含子区（33.30%~40.29%）和基因间区（7.85%~9.53%）（图1（a））。CircRNA鉴定在两组中共识别出10 081个高置信度circRNAs（图1（b）），且通过与circBase数据库比对发现多为新预测的circRNAs。

2.2　差异表达circRNAs筛选

PCA结果显示（图2（a）），control与co-culture组样本在主成分空间中分布较为集中，组间无明显分离趋势，表明共培养环境下牛肌内脂肪细胞circRNA表达谱的整体差异较小。进一步通过韦恩图分析两组间circRNAs的组成分布（图2（b）），结果发现control组特有circRNAs 3 881个，co-culture组特有circRNAs 3 465个，两组共有的circRNAs为2 735个。为深入探究共培养环境对牛肌内脂肪细胞circRNA表达的具体影响，本研究采用edgeR软件对两组样品进行差异表达分析，共鉴定出51个差异表达的circRNAs（图2（c））。其中，与control组相比，co-culture组中显著上调的circRNAs有16个，显著下调的circRNAs有35个。为验证测序数据的可靠性，随机选取8个差异表达的circRNAs进行RT-qPCR验证。结果显示，这8个circRNAs在RT-qPCR检测中的表达趋势与测序结果完全一致（图2（d）），表明本研究的测序数据准确可靠，可支持后续分析。

2.3　差异circRNAs来源基因的功能富集分析

为深入解析差异表达circRNAs的潜在生物学功能，本研究对其来源基因进行了GO与KEGG富集分析。GO富集分析结果显示（图3（a）），差异表达circRNAs的来源基因参与了多种生物学过程（Biological process），主要集中在细胞过程（Cellular process，GO：0009987）和代谢过程（Metabolic process，GO：0008152）；在细胞组分（Cellular component）方面，主要富集于细胞器（Organelle，GO：0043226）和膜结构（Membrane，GO：0016020）；在分子功能（Molecular function）层面，则主要富集于催化活性（Catalytic activity，GO：0003824）和核酸结合转录因子活性（Nucleic acid binding transcription factor activity，GO：0001071）。进一步对富集显著性排名前20的GO条目进行分析（图3（b）），发现部分条目达到显著富集水平，如组蛋白甲基转移酶活性（Histone methyltransferase activity，GO：0042054；P=0.000 368）和胞内细胞器膜（Intracellular membrane-bounded organelle，GO：0043231；P=0.000 444）等，提示差异circRNA可能参与表观调控及细胞内运输过程。KEGG通路富集分析显示（图4（a）），差异circRNA的来源基因共富集于85条信号通路中，包括细胞外基质-受体相互作用通路（ECM-receptor interaction， ko04512；P=0.019 546）和Wnt信号通路（Wnt signaling pathway，ko04310；P=0.066 37）等（图4（b））。

2.4　circRNA-miRNA-mRNA调控网络构建

为探究差异表达circRNAs潜在的分子调控机制，本研究基于差异表达的circRNAs，结合课题组前期在同一共培养条件下筛选获得的差异表达miRNA及成脂分化相关mRNA，构建了ceRNA调控网络。结果显示（图5（a）），共鉴定出42个潜在的ceRNA调控关系对，涉及8个circRNAs、21个miRNAs及14个mRNA，形成了复杂的circRNA-miRNA-mRNA共表达调控网络。以novel_circ_002953为核心的ceRNA亚网络在整个调控网络中占据核心位置，其可通过吸附novel-m0001-3p、novel-m0002-3p和miR-735-y等8个miRNAs而发挥关键的调控作用（图5（b））。其中，以novel-m0002-3p为中心的ceRNA亚网络也表现出较高的连接度，处于整体网络的枢纽地位。novel-m0002-3p可通过靶向PSAP和DHCR24等成脂分化相关基因，进一步参与脂质代谢调控。此外，novel_circ_002953和novel_circ_006185可共同靶向novel-m0108-3p调控脂质代谢标志基因WNT5A和ZBTB16等的表达（图5（a）和（b））。

3　讨 论

肌内脂肪含量是决定牛肉品质的关键经济性状，其沉积过程受到骨骼肌细胞微环境的影响^［21］。骨骼肌细胞作为肌内脂肪细胞的邻近细胞，其可通过旁分泌信号或直接接触方式调节脂肪细胞的生物学功能^［22］。这种“肌-脂互作轴”的存在已被广泛认可，但骨骼肌微环境如何通过非编码RNA网络影响脂肪细胞代谢命运，其分子机制尚待阐明。本研究利用Transwell共培养模型模拟肌-脂互作微环境，结合circRNA高通量测序，探究了共培养环境下牛肌内脂肪细胞中circRNA的表达图谱变化。PCA发现，单一培养与共培养的牛肌内脂肪细胞样本在转录组层面无明显分离趋势，推测共培养环境并未引发肌内脂肪细胞中circRNAs表达谱的全局性改变。差异分析筛选出的51个差异表达circRNAs体现了其存在局部精细调控的作用模式。这说明骨骼肌细胞可能通过调控特定非编码RNA节点，而非大规模重构肌内脂肪细胞的转录程序，来实现对脂质代谢功能的调控。

值得注意的是，差异表达circRNAs的来源基因显著富集于组蛋白甲基转移酶活性等GO条目中。组蛋白甲基化修饰是决定骨骼肌内脂质代谢与脂肪细胞分化和功能的关键表观遗传调控方式^［23-24］。既往研究表明，由m⁶A修饰介导的circCDYL翻译及其衍生肽可通过调控组蛋白甲基化相关的转录抑制复合物从而驱动心脏肥厚进程^［25］。尽管circRNA不直接编码蛋白，但组蛋白修饰的蛋白质和酶复合物能通过ncRNA的导向作用于特定基因的启动子^［26-27］。由此推测，共培养环境下差异表达的circRNA可能通过招募或阻抑组蛋白甲基转移酶复合物，影响其来源基因或远端靶基因的表达状态，从而参与成脂程序的表观调控。

KEGG通路分析揭示了共培养环境影响脂肪细胞功能的潜在信号节点ECM-受体相互作用通路和Wnt信号通路。ECM不仅是细胞的结构支架，还对细胞存活、附着、扩散、迁移等基本功能以及发育和稳态的建立与维持至关重要^［28］。ECM-受体相互作用是细胞感知和响应外部环境的关键机制。具体而言，ECM可通过其分子（如THBS1和FN1）与细胞表面的受体特异性结合，从而将细胞外信号传递到细胞内^［28-29］。其中，整合素是ECM蛋白的主要受体（如ITGAV、ITGB3/4和ITGA2），其可作为连接ECM与细胞内骨架的“桥梁”，介导局部粘连的形成和细胞内信号传导，最终影响细胞功能。此外，肌肉中的ECM-受体的相互作用可影响肌内脂肪细胞的分化以及脂质合成和代谢，从而改变肌内脂肪的含量^［30］。另一方面，Wnt信号通路是决定间充质干细胞命运抉择的经典通路，其激活状态通常抑制成脂分化进程^［31］。在牛骨骼肌微环境中，Wnt信号通路还参与调控纤维/脂肪祖细胞与肌卫星细胞间的旁分泌效应^［32］。纤维/脂肪祖细胞不仅自身响应Wnt信号，亦可分泌Wnt配体影响卫星细胞功能。研究表明，阻断GSK3活性（即Wnt信号通路状态改变）可抑制纤维/脂肪祖细胞的成脂分化，同时增强其对肌卫星细胞的旁分泌效应，从而促进肌管形成^［32］。值得注意的是，近期研究揭示circRNA可通过多种机制调控Wnt信号通路，例如circPHF14已被证实可影响Wnt/β-catenin通路活性^［33］。由此推测，共培养环境可能通过调控circRNA的表达来影响Wnt信号的活性，进而参与肌内脂肪生成的调控。

本研究构建了以novel_circ_002953为核心的ceRNA调控网络。novel_circ_002953可能通过竞争性吸附novel-m0002-3p等miRNA，调控下游靶基因表达。其中，novel-m0002-3p靶向的DHCR24和PSAP尤其值得关注。DHCR24是胆固醇生物合成途径的末端酶，催化链甾醇转化为胆固醇^［34］。在脂肪细胞中，胆固醇稳态与脂滴形成和脂肪因子分泌密切相关。PSAP则可通过参与鞘脂代谢，影响胰岛素抵抗和脂质稳态^［35］。由此说明，novel_circ_002953-novel-m0002-3p-DHCR24/PSAP轴可能在共培养环境下，通过影响胆固醇合成和调节鞘脂代谢，影响肌内脂肪的沉积效率。此外，novel_circ_002953和novel_circ_006185可共同靶向novel-m0108-3p调控脂质代谢标志基因WNT5A和ZBTB16的表达。WNT5A是Wnt基因家族成员之一，能够提高游离胆固醇水平并促进脂肪细胞肥大^［36-37］。ZBTB16（亦称PLZF或ZFP145）属于锌指蛋白家族成员，其作为脂肪生成的新型候选调节因子，可促进白色脂肪生成，并诱导牛肌内前脂肪细胞的棕色化^［38］。综上，本研究揭示了牛骨骼肌微环境通过诱导肌内脂肪细胞中特定circRNA的差异表达及其介导的ceRNA调控网络，为深入理解肌-脂互作机制及改善牛肉品质提供了新的分子靶点和理论依据。

4　结 论

本研究通过Transwell共培养模型模拟骨骼肌细胞对肌内脂肪细胞的旁分泌作用，系统鉴定了牛肌内脂肪细胞中响应共培养信号的circRNA，并构建了以novel_circ_002953为核心的ceRNA调控网络。本研究不仅丰富了牛circRNA数据库，也为理解肌肉-脂肪旁分泌互作机制提供了新视角，为今后通过分子育种手段改良牛肉品质提供了潜在的候选分子靶点。

参考文献

[1] Klurfeld D M. The whole food beef matrix is more than the sum of its parts［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2024， 64（14）： 4523-4531

[2] Yu H W， Yu S C， Guo J T， Wang J F， Mei C G， Abbas Raza S H， Cheng G， Zan L S. Comprehensive analysis of transcriptome and metabolome reveals regulatory mechanism of intramuscular fat content in beef cattle［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2024， 72（6）： 2911-2924

[3] Wang L S， Gao P D， Li C Y， Liu Q L， Yao Z Y， Li Y X， Zhang X J， Sun J W， Simintiras C， Welborn M， McMillin K， Oprescu S， Kuang S H， Fu X. A single-cell atlas of bovine skeletal muscle reveals mechanisms regulating intramuscular adipogenesis and fibrogenesis［J］. Journal of Cachexia， Sarcopenia and Muscle， 2023， 14（5）： 2152-2167

[4] Song Y P， Zhang J P， Yang D M， Jiang C， Raza S H A， Pant S D， Ma Y， Zan L S， Wei D W. APOE mediates the coupling of myogenesis and lipid metabolism in skeletal muscle： Decoding intercellular crosstalk via a cell co-culture model ［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2025， 315： 144549

[5] Guo L， Xu J F， Zhou W Y， Chen S S， Shi H J， Han M M， Yang Z K， Duan Y H， Pang W J， Yin Y L， Li F N. Metabolome and RNA-seq reveal discrepant metabolism and secretory metabolism profile in skeletal muscle between obese and lean pigs at different ages［J］. Science China Life Sciences， 2025， 68（4）： 1102-1117

[6] Qin C Y， Xu F， Yue B L， Zhong J C， Chai Z X， Wang H. SRSF3 and hnRNP A1-mediated m6A-modified circCDK14 regulates intramuscular fat deposition by acting as miR-4492-z sponge ［J］. Cellular & Molecular Biology Letters， 2025， 30（1）： 26

[7] Wen W J， Yuan L， Zhao X Y， Jia Y， Chen L N， Jiang H Y， Wang W， Zhang C Y， Yao S Z. Differentially expressed circular RNA profiles and comprehensive analysis of circRNA-miRNA-mRNA regulatory network in microsatellite instability-high endometrial cancer ［J］. Genomics， 2024， 116（5）： 110931

[8] Huang X Y， Huang Z L， Xu Y H， Zheng Q， Chen Z， Song W， Zhou J， Tang Z Y， Huang X Y. Comprehensive circular RNA profiling reveals the regulatory role of the circRNA-100338/miR-141-3p pathway in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma ［J］. Scientific Reports， 2017， 7： 5428

[9] Jo D， Lim Y H， Jung Y S， Kim Y K， Song J. Circular RNA Tmcc1 improves astrocytic glutamate metabolism and spatial memory via NF-κB and CREB signaling in a bile duct ligation mouse model： Transcriptional and cellular analyses ［J］. Journal of Neuroinflammation， 2023， 20（1）： 121

[10] Alfonso-Gonzalez C， Shi M J， Gorey S， Holec S， Carrasco J， Rauer M， Tsagkris S， Mateos F， Hilgers V. ELAV mediates circular RNA biogenesis in neurons［J］. Genes & Development， 2025， 39（17/18）： 1064-1080

[11] Chen R， Yang T T， Jin B， Xu W R， Yan Y W， Wood N， Lehmann H I， Wang S Q， Zhu X L， Yuan W L， Chen H J， Liu Z Y， Li G P， Bowen T S， Li J， Xiao J J. CircTmeff1 promotes muscle atrophy by interacting with TDP-43 and encoding a novel TMEFF1-339aa protein ［J］. Advanced Science， 2023， 10（17）： 2206732

[12] Huang K W， Li Z P， Zhong D D， Yang Y F， Yan X Y， Feng T， Wang X B， Zhang L Y， Shen X Y， Chen M J， Luo X E， Cui K Q， Huang J P， Rehman S U， Jiang Y， Shi D S， Pauciullo A， Tang X F， Liu Q Y， Li H. A circular RNA generated from nebulin （NEB） gene splicing promotes skeletal muscle myogenesis in cattle as detected by a multi-omics approach ［J］. Advanced Science， 2024， 11（3）： 2300702

[13] Zhang S H， Jiang E H， Kang Z H， Bi Y， Liu H F， Xu H， Wang Z， Lei C Z， Chen H， Lan X Y. CircRNA profiling reveals an abundant circBDP1 that regulates bovine fat development by sponging miR-181b/miR-204 targeting Sirt1/TRARG1 ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2022， 70（44）： 14312-14328

[14] Yu S C， Wang J F， Liu H B， Guo J T， Kuraz A B， Pan Y T， Li A N， Mei C G， Cheng G， Zan L S. CircGLIS3 inhibits intramuscular adipogenesis and alleviates skeletal muscle fat infiltration［J］. Journal of Cachexia， Sarcopenia and Muscle， 2025， 16（4）： e70009

[15] Yin Y J， Ma J Q， Yue B L， Zhong J C， Shi H T， Wang H. CircVPS¹³C promotes intramuscular adipogenesis via miR-5606-X-ECHDC3 axis in yaks （Bos grunniens）［J］. Biomolecules， 2026， 16（2）： 202

[16] Ma J Q， Yin Y J， Meng X， Huang C， Xie Z L， An X， Wang H B， Chai Z X， Zhong J C， Wang H. Super-enhancer-associated circRHOQ regulates intramuscular fat deposition by modulating the miR-5093/IRF5 axis ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2025， 73（48）： 30904-30921

[17] He X， Xie F， Nie Y， Wang X F， Luo J Y， Chen T， Xi Q Y， Zhang Y L， Sun J J. A novel protein encoded by porcine circANKRD17 activates the PPAR pathway to regulate intramuscular fat metabolism［J］. Journal of Animal Science and Biotechnology， 2025， 16（1）： 19

[18] 杨东梅， 张久盘， 宋雅萍， 宋小雨， 姜超， 马云， 魏大为. 共培养体系下牛骨骼肌细胞对脂肪细胞的调控作用研究［J］. 中国农业科学， 2024，57（18）：3704-3718

[19] Yang D M， Zhang J P， Song Y P， Song X Y， Jiang C， Ma Y， Wei D W. Research on the regulatory effects of bovine skeletal muscle cells on adipocytes under co-culture conditions［J］. Scientia Agricultura Sinica， 2024， 57（18）： 3704-3718 （in Chinese）

[20] Mu H Y， Chen J Z， Huang W J， Huang G， Deng M Y， Hong S M， Ai P， Gao C， Zhou H K. OmicShare tools： A zero-code interactive online platform for biological data analysis and visualization ［J］. iMeta， 2024， 3（5）： e228

[21] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 ^{- ΔΔCT}method ［J］. Methods， 2001， 25（4）： 402-408

[22] Yang D M， Song Y P， Gong H F， Jiang C， Jiao R P， Ma Y L， Abbas Raza S H， Pant S D， Ma Y， Zhang G J， Zan L S， Wang S H， Zhang J P， Wei D W. Critical lncRNA screening and CeRNA network Construction in bovine skeletal muscle cells and intramuscular adipocytes co-culture model［J］. Gene， 2026， 974： 149845

[23] Song Y P， Wei D W， Raza S H A， Zhao Y A， Jiang C， Song X Y， Wu H， Wang X P， Luoreng Z， Ma Y. Research progress of intramuscular fat formation based on co-culture［J］. Animal Biotechnology， 2023， 34（7）： 3216-3236

[24] Wang Y H， Xie H， Liu Q R， Wang N， Luo X， Sun F， Zhu J H， Dong R H， Wang Y， Gao J， Gao Z C， Huang T， Liu X， Yu Q L， Wang T， Li Y， Song D N， Liu S W， Zhang S， Yin H， Kong W， Wang C Y. Kdm2a inhibition in skeletal muscle improves metabolic flexibility in obesity［J］. Nature Metabolism， 2025， 7（2）： 383-400

[25] Kang H S， Lee J H， Oh K J， Lee E W， Han B S， Park K Y， Suh J M， Min J K， Chi S W， Lee S C， Bae K H， Kim W K. IDH1-dependent α-KG regulates brown fat differentiation and function by modulating histone methylation ［J］. Metabolism， 2020， 105： 154173

[26] Li M Y， Ding W， Fang X Y， Wang Y， Wang P Y， Ye L， Miao S， Song L， Ao X， Li Q， Wang J X. Novel truncated peptide derived from circCDYL exacerbates cardiac hypertrophy［J］. Circulation Research， 2025， 136（10）： e94-e112

[27] Zhu Y， Hu Z X， Liu J S， Duan H Q， Zeng J Q， Li X S， Tang Y， Song Z L， Wu Z P， Zhang S R， Zhang Y X， Qiu F， Lu C. Epigenetic-ncRNA crosstalk in atherosclerosis： Mechanisms， disease progression and therapeutic potential （Review）［J］. International Journal of Molecular Medicine， 2025， 56（5）： 1-17

[28] Bure I V， Nemtsova M V， Kuznetsova E B. Histone modifications and non-coding RNAs： Mutual epigenetic regulation and role in pathogenesis ［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（10）： 5801

[29] Hu W X， Feng P， Zhang M M， Tian T， Wang S X， Zhao B Y， Li Y J， Wang S， Wu C C. Endotoxins induced ECM-receptor interaction pathway signal effect on the function of MUC₂ in Caco2/HT29 co-culture cells ［J］. Frontiers in Immunology， 2022， 13： 916933

[30] Geiger B， Bershadsky A， Pankov R， Yamada K M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2001， 2（11）： 793-805

[31] San J S， Du Y T， Wu G F， Xu R F， Yang J C， Hu J M. Transcriptome analysis identifies signaling pathways related to meat quality in broiler chickens-the extracellular matrix （ECM） receptor interaction signaling pathway ［J］. Poultry Science， 2021， 100（6）： 101135

[32] Mahajan A， Nengroo M A， Datta D， Katti D S. Converse modulation of Wnt/β-catenin signaling during expansion and differentiation phases of Infrapatellar fat pad-derived MSCs for improved engineering of hyaline cartilage ［J］. Biomaterials， 2023， 302： 122296

[33] Zhang J F， Wang E Z， Li Q， Peng Y H， Jin H N， Naseem S， Sun B， Park S， Choi S， Li X Z. GSK3 regulation Wnt/β-catenin signaling affects adipogenesis in bovine skeletal muscle fibro/adipogenic progenitors［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2024， 275： 133639

[34] Fang Z， Wu Z， Yu C， Xie Q Y， Zeng L T， Chen R F. EIF4E-mediated biogenesis of circPHF14 promotes the growth and metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma via Wnt/β-catenin pathway ［J］. Molecular Cancer， 2025， 24（1）： 56

[35] Sliz E， Shin J， Syme C， Patel Y， Parker N， Richer L， Gaudet D， Bennett S， Paus T， Pausova Z. A variant near DHCR24 associates with microstructural properties of white matter and peripheral lipid metabolism in adolescents［J］. Molecular Psychiatry， 2021， 26（8）： 3795-3805

[36] He Y C， Kaya I， Shariatgorji R， Lundkvist J， Wahlberg L U， Nilsson A， Mamula D， Kehr J， Zareba-Paslawska J， Biverstål H， Chergui K， Zhang X Q， Andren P E， Svenningsson P. Prosaposin maintains lipid homeostasis in dopamine neurons and counteracts experimental Parkinsonism in rodents［J］. Nature Communications， 2023， 14： 5804

[37] Guo Y Q， Zhang Z Y， Dong L T， Shi X Y， Li X H， Luo M X， Fu Y J， Gao Y J. Wnt5a augments intracellular free cholesterol levels and promotes castration resistance in prostate cancer［J］. Journal of Translational Medicine， 2025， 23（1）：347

[38] Lee G J， Kim Y J， Park B， Yim S， Park C， Roh H， Moon Y， Seong J K， Park H. YAP-dependent Wnt5a induction in hypertrophic adipocytes restrains adiposity［J］. Cell Death & Disease， 2022， 13：407

基金资助

宁夏自然科学基金项目(2025AAC040003)

宁夏自然科学基金项目(2025AAC030558)

国家自然科学基金项目(32460819)

中央引导地方专项(2024FRD05052)

宁夏重点研发计划(2023BCF01006)

宁夏重点研发计划(2024BBF01007)

宁夏青年拔尖人才项目(宁人社函［2026］33)