彩色马铃薯TOE3亚族的筛选、鉴定与表达分析

Screening, identification, and expression analysis of the TOE3 subfamily in colored potatoes

摘要

为鉴定参与彩色马铃薯块茎花青素合成相关的AP2/ERF转录因子家族中TOE3亚族成员，基于马铃薯转录组数据，筛选AP2基因家族中的TOE3亚族成员，利用TBtools，MEGA11、NCBI-CD Search等组学工具分析其染色体定位、系统进化和表达模式，并通过qRT-PCR验证6个StTOE3亚族基因在紫肉马铃薯‘华颂66’和白肉马铃薯‘大西洋’块茎中不同生育时期的表达情况。结果表明：筛选得到马铃薯块茎花青素合成相关的AP2家族成员30个，可划分为12个亚族，其中19个基因参与物种内复制，并产生9对共线性基因且未检测到明显的串联基因复制事件。其中TOE3亚族共鉴定到6个StTOE3基因，启动子均富含脱落酸、水杨酸和光响应元件。qRT-PCR显示，StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5在‘华颂66’块茎形成期（块茎花青素快速积累期）表达显著高于‘大西洋’；StTOE3‑2和StTOE3‑7的表达量均在块茎成熟期达到峰值，在2个不同颜色品种块茎中的表达量无显著差异；而StTOE3‑6在白肉‘大西洋’中表达显著高于‘华颂66’。StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5的表达模式与‘华颂66’紫肉马铃薯块茎花青素积累时期高度一致，可作为彩色马铃薯花青素合成正向调控的关键候选基因。

Abstract

To identify members of the TOE3 subfamily within the AP2/ERF transcription factor family involved in anthocyanin biosynthesis in colored potato tubers， TOE3 subfamily members were screened from the AP2 gene family based on potato transcriptome data. Their chromosomal localization， phylogenetic relationships， and expression patterns were analyzed using bioinformatics tools including TBtools， MEGA11， and NCBI-CD Search. The expression profiles of six StTOE3 genes were further validated via qRT-PCR using tubers of the purple-fleshed potato cultivar ‘Huasong 66’ and white-fleshed cultivar ‘Atlantic’ sampled at different tuber growth stages. The results showed that： A total of 30 AP2 family members associated with anthocyanin synthesis in potato tubers were identified and classified into 12 subfamilies， among which 19 genes were involved in whole-genome duplication events， generating 9 pairs of collinear genes with no significant tandem genes were identified within the TOE3 subfamily. Segmental duplication played a predominant role in their evolution and expansion. A total of 6 StTOE3 genes were identified in the TOE3 subfamily， all of which contained promoters rich in abscisic acid， salicylic acid-， and light-responsive elements. qRT-PCR analysis revealed that StTOE3‑1， StTOE3‑3， and StTOE3‑5 exhibited significantly higher expression levels in ‘Huasong 66’ during tuber formation stage （the rapid anthocyanin accumulation stage） than that in ‘Atlantic’. Expression of StTOE3‑2 and StTOE3‑7 reached peak at the tuber maturation stage， with no significant difference between the two varieties. In contrast， StTOE3‑6 was expressed significantly higher in the white-fleshed ‘Atlantic’ than in ‘Huasong 66’. The expression patterns of StTOE3‑1， StTOE3‑3， and StTOE3‑5， their expression patterns line up really well with when ‘Huasong 66’ potato tubers accumulate anthocyanins， suggesting they are key candidate genes positively regulating anthocyanin biosynthesis in colored potatoes.

Graphical abstract

关键词

彩色马铃薯 / AP2/ERF转录因子 / TOE3亚族 / 花青素 / 表达模式

Key words

colored potatos / AP2/ERF transcription factors / TOE3 subfamily / anthocyanins / expression pattern

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄属作物，兼具高产、耐旱、耐瘠及“省水、省肥、省药”的特性，使其在保障粮食安全、应对气候变化和贫困山区产业扶贫中扮演关键角色^［1-2］。马铃薯块茎含有丰富的膳食纤维，马铃薯膳食纤维含量可达1.7 g/100 g，是小麦的4倍^［3］。传统栽培马铃薯以白肉或黄肉为主，块茎中类胡萝卜素含量有限，抗氧化能力较低，难以兼顾当下消费者对马铃薯食用品质与营养功能的双重需求。彩色马铃薯是一类特殊的马铃薯，块茎中积累大量的花青素，薯皮或薯肉呈现红、紫、紫红等颜色^［4］，随着市场对功能性食材需求的持续增长，彩色马铃薯的开发潜力日益凸显^［5］。然而，现有品种普遍存在花青素积累不稳定，且优良种质资源匮乏，制约了产业发展。因此，选育块茎花青素含量更高且积累稳定的彩色马铃薯种质，对马铃薯种质创新和营养品质提升具有重要的意义。

花青素广泛存在于植物体内，是植物次级代谢过程的产物^［6］。一般情况下，花青素并不能在植物中稳定存在，只有在发生糖基化的情况下才能形成稳定的花青苷，为植物的花、叶、果实及种子等组织赋予颜色，其颜色范围可从橙色、红色、粉色、紫色一直到蓝色^［7-8］。花青素是植物中广泛存在的天然色素，是极具研究价值的活性物质，具有清除自由基、抗氧化、降血糖、抑菌消炎、减缓肝脏负担和抑制肿瘤细胞等作用^［9］。因此，花青素在未来的食品工业、医药研发及营养保健领域展现出广阔的应用前景和巨大的开发潜力^［10］。花青素的生物合成可以分为3个阶段：基础代谢→苯丙氨酸→花青素苷元→稳定的花青素。第一阶段是生成关键前体物质‘苯丙氨酸’，这一过程是所有类黄酮（包括花青素、黄酮、异黄酮等）的共同起点；第二阶段是花青素合成的核心阶段，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）等一系列特异性酶催化合成；第三阶段形成的花青苷易被降解氧化，植物通过糖基化、酰基化、甲基化增强其稳定性后，通过转运蛋白将其转运并储存在液泡中^［11-14］。花青素的合成受许多结构基因、调控基因和其他调控因子调节^［15］。结构基因主要是编码花青素合成过程中的相关酶；调控基因主要是MYB、bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）和WD40三类转录因子，它们通常形成1个MBW复合体（MYB-bHLH-WD40）促进花青素的合成^［16］。花青素的合成还受到bZIP、AP2/ERF、WRKY等多个转录因子家族的调控^［15］。

AP2/ERF（APETALA2/Ethylene-responsive factor）基因家族是植物特有的、最大的转录因子基因家族之一，家族成员均包含至少1个约60个氨基酸残基组成的AP2结构域^［17-18］。AP2/ERF超家族是一个庞大且复杂的家族，根据AP2/ERF结构域的相似性，该基因家族可划分为AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist等多个亚家族^［19］。其中，根据AP2结构域的数量，可将其主要分为两大类：AP2亚家族通常含有2个AP2结构域，主要参与调控植物生长发育和器官的建成等过程；ERF亚家族仅有1个AP2结构域，专注于介导植物的应激反应和信号传导^［20-21］。近年来，越来越多的研究揭示了AP2/ERF转录因子在调控植物次生代谢中的关键作用。DREB亚族成员LhERF061通过直接结合并抑制LhMYBSPLATTER和LhDFR的表达，进而抑制花青素的积累，还通过竞争结合LhMYBSPLATTER蛋白，影响MBW复合物的正调控作用，多途径抑制百合花青苷生物合成^［22］。在苹果中，MdERF38可与花青素合成途径的正向调控因子MdMYB1互作，通过增强MdMYB1的转录激活活性，促进其与下游结构基因启动子区域的结合效率，进而上调靶基因的表达水平，最终加速花青素的生物合成和积累^［23］。由乙烯激活的PyERF105可促进抑制型基因PyMYB140的表达，从而抑制红皮梨果实中花青素的合成^［24］。参考拟南芥AP2转录因子亚家族的分类标准，共分为13个亚族，包括AP2型、RAP27型、T11A7.19型、WRI1型、ADAP型、ANT型、AIL5型、AIL6型、AIL1型、BBM型、PLT1型、PLT2型和TOE型^［25］。其中，TOE亚族的结构域含有2段保守的氨基酸序列，分别命名为YRG和RAYD元件^［26］。目前，关于TOE型AP2转录因子的已知功能主要聚焦在其对植物开花时间的调控和根再生调控^［27-28］，而TOE亚组对花青素合成的直接调控作用及其分子机制仍尚未见报道。本研究基于不同颜色马铃薯块茎转录组表达谱，采用生物信息学方法对马铃薯中TOE3亚族成员进行鉴定，全面分析其理化性质、蛋白质保守基序、顺式作用元件等，并通过RNA-seq分析及qRT-PCR验证，旨在筛选彩色马铃薯中与块茎花青素合成相关的TOE3亚族成员，以期为马铃薯种质创新提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

以紫皮紫肉马铃薯‘华颂66’（HS66）以及黄皮白肉马铃薯‘大西洋’（DXY）的块茎为供试材料。试验材料的选用和处理方案参照马杰茹等^［29］的方法。

1.2　马铃薯AP2亚家族的筛选

基于不同颜色马铃薯块茎薯肉的转录组数据^［29］，以“AP2 domain”为关键词筛选含有该结构域的候选AP2亚家族成员，随后通过NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）验证其保守结构域的完整性，剔除结构域不完整的假基因，利用DNAMAN软件进行氨基酸多序列比对，剔除相似性≥99%的重复基因。重点关注紫皮紫肉品种‘华颂66’和黄皮白肉品种‘大西洋’表达存在显著差异的基因；对于在试验材料各生育时期表达量均为0的基因，其参与花青素合成的可能性较低，故予以剔除。最终确定在转录组数据中可检测的马铃薯AP2亚家族成员。

1.3　马铃薯AP2亚家族成员系统发育分析

从The Arabidopsis Information Resource（TAIR）数据库获取14个拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP2亚家族成员的蛋白质序列，从NCBI下载其他物种TOE3的蛋白质序列，整合马铃薯块茎薯肉的转录组数据最终获得的AP2亚家族成员蛋白序列。利用MEGA11.0软件进行多序列比对，选择邻接法（NJ，neighbor-joining）作为建树方法，设置校验参数（bootstrap）为1 000，其余参数为默认值；采用在线网站EvolView（https：//www.evolgenius.info/evolview）对系统进化树进行可视化处理。

1.4　马铃薯AP2亚家族种内及种间共线性分析

基于双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）及茄科作物番茄（Solanum lycopersicum）的完整基因组序列及注释文件，通过TBtools中Advanced Circos功能模块构建马铃薯基因组内相关共线性图谱，借助MCScanX对马铃薯与拟南芥和番茄AP2亚家族之间的共线性关系进行分析，从而系统解析该家族在拟南芥和番茄分化背景下的线性保守特征。

1.5　马铃薯AP2亚家族成员的染色体定位及表达模式分析

根据马铃薯转录组数据的基因注释文件中AP2亚家族成员染色体位置信息，通过MG2C v2.1在线网站绘制染色体定位图。将|log₂（Fold Change）|>0且P<0.05作为差异显著性标准，比较AP2亚家族成员在‘华颂66’块茎形成期（H₁）vs‘大西洋’块茎形成期（D₁）、‘华颂66’块茎膨大期（H₂）vs‘大西洋’块茎膨大期（D₂）和‘华颂66’块茎成熟期（H₃）vs‘大西洋’块茎成熟期（D₃）中的差异表达基因，并使用联川生物云平台绘制差异表达热图。

1.6　马铃薯StTOE3转录因子理化性质分析

通过在线分析软件Expasy中的ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）对马铃薯StTOE3转录因子的理化性质进行分析，包括氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点及亲疏水性等指标；借助Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）对StTOE3蛋白进行亚细胞定位预测。

1.7　差异表达StTOE3蛋白结构分析

通过在线分析软件SOPMA secondary structure prediction（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测StTOE3蛋白质二级结构；TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）预测其跨膜区域；SingalP-4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）预测StTOE3蛋白质的信号肽。

1.8　差异表达StTOE3基因启动子顺式作用元件分析

利用TBtools从马铃薯转录组数据中提取StTOE3成员基因上游2 000 bp启动子序列，利用PlantCARE在线网站（htp：/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子顺式作用元件分析，使用Excel统计各类激素和胁迫响应元件的数量并使用TBtools可视化分析结果。

1.9　差异表达StTOE3基因保守基序及保守结构域分析

利用在线分析网站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）对筛选出的StTOE3蛋白进行保守基序预测，设定motif<10；利用NCBI-CD search在线工具分析StTOE3蛋白的保守结构域，导入TBtools软件进行可视化分析。

1.10　差异表达StTOE3基因qRT-qPCR验证

利用Trizol法^［30］提取不同马铃薯品种不同时期块茎总RNA，使用FastKing RT Kit（With gDNase）cDNA第一链合成试剂盒（KR116-02）反转录合成cDNA，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，以Actin为内参基因，并委托上海生工进行引物合成（表1）。qRT-PCR试验过程中采用苏州莫纳生物（Monad）科技有限公司生产的MonAmpTM SYBR^® Green qPCR Mix试剂进行反应，3次技术重复，3次生物学重复。用2^{-∆∆CT［31］}计算基因的相对表达量。

2　结果与分析

2.1　马铃薯AP2亚家族成员筛选

基于马铃薯块茎转录组数据，初步筛选共得到53个具备AP2结构域的候选基因，经NCBI-CDD保守结构域验证，其中50个基因的编码蛋白序列存在典型且完整的AP2保守结构域。对上述50个AP2家族蛋白氨基酸序列进行序列比对，剔除序列相似度≥99%的重复基因，最终筛选出30个马铃薯AP2家族转录因子基因，见表2。

2.2　马铃薯AP2亚家族基因进化树分析

参考拟南芥AP2亚家族的分类标准，马铃薯AP2基因家族可划分为TOE、RAP27、WRI等12个亚族（图1），其中StTOE3、StANT、StWRI和StAIL6亚族中的C88_C11H1G003680成员，与拟南芥分类体系完全对应。StTOE3和潘那利番茄SpTOE3、高梁SbTOE3、黄瓜CsTOE3、枸杞LbTOE3、烟草NtTOE3聚在一个分支，说明TOE3亚族基因在进化上高度保守，且StTOE3‑6与SpTOE3、StTOE3‑5、NtTOE3序列相似性均较高，亲缘关系较近。马铃薯StRAP27、StAIL5亚族基因呈现出明显的间隔分布模式，这一结果表明，即便二者被划分为同一亚族，其在长期的进化过程中仍可能已经分化出不同的功能。

2.3　马铃薯AP2亚家族种内及种间共线性分析

由图2可知，分布在马铃薯8条染色体11个位点的19个AP2基因发生种内复制，形成9对共线性同源基因，分别为StTOE3‑2与StTOE3‑1、StTOE3‑3，ANT亚族中C88_C02H4G122810与C88_C04H3G093860，AIL6亚族中C88_C11H1G003680与C88_C05H1G020860，RAP27亚族中C88_C11H2G050170与C88_C11H1G024960、C88_C10H1G022580，以及AP2L1亚族中C88_C03H2G064220、C88_C09H4G095390与C88_C10H1G022580、C88_C11H1G024960。

由图3可知，马铃薯与拟南芥、番茄分别有14 264、26 662对共线性关系，其中马铃薯AP2家族基因与拟南芥存在9对共线性基因，与番茄存在16对共线性基因，表明马铃薯与番茄的亲缘关系较拟南芥更近。

2.4　马铃薯AP2亚家族基因染色体定位及表达模式分析

由图4可知，马铃薯AP2亚家族成员分布在1、2、3、4、5、7、8、9、10和11号染色体上。其中，StWRI亚族基因全部分布在1号染色体上，TOE3基因主要聚集在2号染色体上，StTOE3‑7和StAP2L1亚族基因C88_C03H2G064220位于3号染色体的第2单倍型，StRAP27亚族基因分布在9、10、11号染色体上。

由图5可知，马铃薯块茎形成期、膨大期和成熟期的紫肉‘华颂66’块茎中C88_C10H3G080600（StRAP27）表达水平均高于白肉马铃薯‘大西洋’；而‘大西洋’中C88_C09H4G095390（StRAP27）、C88_C05H1G020860（StAIL6）、StTOE3‑6、C88_C07H1G006610（StAIL5）、C88_C01H1G032430（StWRI）和StANT亚组中C88_C02H4G122810、C88_C04H3G093860、C88_C09H2G033290在上述3个时期块茎中的表达水平均高于‘华颂66’；C88_C01H2G080420（StWRI1）、C88_C01H3G126850（StWRI1）和C88_C11H3G054840（StAIL1）仅在白肉马铃薯‘大西洋’块茎形成期特异性表达，C88_C11H2G030130（StAIL1）仅在紫肉马铃薯‘华颂66’块茎形成期表达。马铃薯TOE3亚组成员在‘华颂66’块茎形成期及花青素积累期表达丰度较高。

在块茎形成期，‘华颂66’中的StTOE3‑1、StTOE3‑2、StTOE3‑3、StTOE3‑5、StTOE3‑7基因的表达均显著高于‘大西洋’，而在块茎成熟期和膨大期，在2个品种中的表达丰度无显著差异，StTOE3‑6在白肉马铃薯块茎中表达量显著高于紫肉，呈现负调控花青素合成基因的典型表达特征。而StTOE3‑4的表达量在‘华颂66’和‘大西洋’中的均较低，因此，后续不做分析。

2.5　马铃薯StTOE3基因生物信息学及蛋白结构分析

蛋白质理化性质结果显示，6个马铃薯TOE3基因编码蛋白分别由370~541个氨基酸组成，相对分子量在41.5~60.6 ku，理论等电点（pI）在6.28~8.71（表3），其中StTOE3-2、StTOE3-6、StTOE3-7为酸性蛋白（pI<7），StTOE3-1、StTOE3-3、StTOE3-5为碱性蛋白（pI>7）；亲疏水性平均值均为负值，具有较强的亲水性，属于亲水蛋白；亚细胞定位预测结果显示，6个马铃薯StTOE3均分布于细胞核，且除StTOE3-2和StTOE3-6外，其余在细胞质上均有分布。蛋白二级结构预测结果表明6个马铃薯TOE3编码的蛋白质均以α螺旋和无规则卷曲为主（图6），α螺旋占比介于14.05%~19.73%，无规则卷曲占比介于69.19%~78.37%，未检测到延伸链和β-折叠结构；6个StTOE3蛋白均无跨膜结构位点和信号肽。

2.6　马铃薯StTOE3启动子顺式作用元件分析

马铃薯TOE3亚族基因的顺式作用元件依其功能可大致划分为3类，分别为激素响应、环境胁迫以及生长发育相关的顺式作用元件（图7）。与激素响应相关的顺式作用元件包括5种，其中6个StTOE3基因均包含水杨酸响应元件（salicylic acid responsive elements）。除StTOE3‑6不含脱落酸响应元件（abscisic acid responsive element），其余5个基因都含有此响应元件。在环境胁迫响应相关的顺式作用元件中，StTOE3‑1、StTOE3‑3、StTOE3‑5和StTOE3‑6均包含厌氧诱导响应元件（分别是3、2、2和1个）；其中StTOE3‑7含有低温响应元件和MYB干旱诱导结合位点各1个。生长发育过程相关的顺式作用元件中，6个基因都包含光响应元件且占比最高。这些结果显示，StTOE3亚族基因的表达受多种植物激素与逆境胁迫的共同影响，其启动子可能通过响应不同植物激素和逆境胁迫信号，调控该基因的表达水平，进而影响马铃薯块茎中花青素的合成。

2.7　马铃薯StTOE3保守基序及保守结构域

由图8可知，motif 1归属于AP2结构域，motif 2归属于AP2 superfamily结构域。StTOE3家族成员中，6个马铃薯成员均包含motif 1、2、3、4、7和8，这些基序按照同样的顺序排列，显示出高度保守的基序结构，表明这6个马铃薯StTOE3可能具有相似的功能。序列比对结果表明，这些蛋白的N端和C端都具有一定的保守性，但C端保守性较N端低。此外，个别成员存在基序缺失现象，如StTOE3-6的C端不具有motif 6，StTOE3-7的C端不具有motif 5、6。StTOE3-7的AP2结构域保守型较低（图9），且RAYD元件中的A突变为S（丙氨酸→丝氨酸），可能影响其转录激活活性。

2.8　不同颜色马铃薯TOE3表达模式的分析

由图10可知，6个马铃薯块茎花青素合成相关的TOE3亚族基因中，StTOE3‑1、StTOE3‑3及StTOE3‑5在紫肉马铃薯‘HS66’块茎形成期（S₁）、膨大期（S₂）、成熟期（S₃）3个生育时期表达趋势一致，均呈现出表达量在S₁时期（即花青素积累时期）高表达，且在S₂、S₃时期表达水平呈缓慢下降趋势；且3个基因在‘HS66’块茎形成期的表达丰度显著高于‘DXY’形成期的块茎。StTOE3‑2和StTOE3‑7在‘HS66’块茎形成期（S₁）的表达水平均显著高于‘DXY’，且均在成熟期表达量达到峰值；而在‘HS66’和‘DXY’2个品种间的表达水平无显著差异。此外，StTOE3‑6在白肉马铃薯‘DXY’各时期块茎中的表达量均显著高于‘HS66’，推测该基因可能负调控马铃薯块茎花青素的合成和积累。

3　讨 论

AP2/ERF超家族是植物特有的转录因子家族，主要通过与转录因子互作激活转录因子、与MBW（MYB-bHLH-WD40）形成调控复合物或直接激活结构基因启动子的方式调控植物花青素的生物合成^［32］。已有研究表明，海棠中MpERF105通过正向调控靶基因MpMYB10b促进花青素积累，同时与MpNAC72形成蛋白复合体，协同增强MpMYB10b的转录水平，可显著提升花青素含量，最终增强植株对苹果锈病的抗性^［33］。MdERF38作为苹果干旱诱导花青素合成的关键蛋白，通过蛋白-蛋白互作增强MdMYB1（正向调控因子）的转录激活活性；而MdBT2（负向调控因子）则通过泛素化降解MdERF38实现该通路的负反馈调控，实现转录与翻译后水平的动态调控^［23］。红皮梨ERF/AP2转录因子PyERF3可与PyMYB114、PybHLH3协同互作，共同调控花青素合成；同时PyMYB114与PyMYB10存在转录相关性，二者共转化可显著提升花青素含量^［34］。上述研究充分印证了AP2/ERF家族成员在植物花青素合成、逆境胁迫应答过程中的核心调控地位，而TOE3作为该家族的重要成员，自被发现以来便成为研究热点，已有大量研究证实其参与调控植物的生殖生长与逆境胁迫应答过程。Jung等^［35］首次报道，miR172靶标TOE3可结合AGAMOUS第二内含子直接抑制其表达；作为miR172介导的开花时间与花型整合调控网络关键节点，TOE3抑制解除（如rTOE3-ox）会显著下调AG表达，引发花序无限化及雄蕊/心皮类器官大量增生，由此揭示miR172通过TOE3同时调控生殖相变和花器官身份决定的分子框架。Jiao等^［36］在烟草的研究中发现，NtTOE3的超表达可显著提高植物对烟草花叶病毒（TMV）的抗性，而敲除NtTOE3则促进了病毒的感染，表明miR172/TOE3调控模块在植物免疫及病毒感染恢复过程中的关键作用。PlTOE3通过特异性结合PlTDC启动子上的GCC-box元件，直接激活褪黑素合成限速酶基因PlTDC的转录，提升内源褪黑素水平，从而显著增强植株的抗氧化能力和膜稳定性，最终赋予芍药及异源烟草更高的高温胁迫耐受性^［37］。关于TOE3直接参与植物花青素合成调控的相关机制尚未见报道。

本研究以不同颜色马铃薯块茎转录组数据为基础，从中共鉴定出RAP27、TOE3、AIL1等12个亚族，共有30个基因。马铃薯AP2基因家族进化分析显示，与模式作物拟南芥AP2亚家族分类体系相比，StTOE3、StANT分别与拟南芥TOE3、ANT亚组聚为一个分支（图1）。在TOE3亚族中，马铃薯与番茄、拟南芥同属茄科，StTOE3‑6与SpTOE3聚在一个分支，亲缘关系最近。StTOE3‑5和NtTOE3序列相似性为70.42%，推测StTOE3‑5在植物免疫中也发挥重要作用。在物种演化过程中，染色体层面的节段复制、串联复制和全基因组复制是不同基因组发生扩张并推动基因家族扩增的关键进化机制^［38］。种内共线性分析发现，30个马铃薯AP2基因中，19个基因参与物种内复制并产生9个同源基因对，发生片段重复的基因复制次数1~3次，且未检测到串联基因复制事件（图4），上述结果证实，片段重复在马铃薯AP2基因家族的进化与扩增过程中起到了主导作用，种间共线性分析发现（图3），马铃薯与番茄之间存在大量保守的共线性关系区段，这表明在进化过程中，马铃薯与番茄具有较近的亲缘关系。

启动子结构分析结果表明（图7），马铃薯StTOE3基因家族启动子区包含丰富的作用元件，主要包括光响应、激素响应和逆境响应元件三大类；其中，ATBP-1结合位点不归属于以上三类顺式作用元件，属于染色质架构辅助元件，不直接感应任何信号^［39］。除光响应元件外，脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）响应元件的占比较高。ABA是植物应对干旱、盐害、低温等非生物逆境胁迫的激素，还能调控种子休眠、萌发及气孔运动等生理过程^［40］；SA在盐胁迫下能激活番茄植物中ABA的积累，最终促进渗透调节和提高光合色素水平，进而改善植株生长状态^［41］。通过蛋白质保守基序和保守结构域分析发现（图8），马铃薯StTOE3蛋白均有2个典型的AP2结构域，符合AP2/ERF超家族的特征定义。AP2和AP2 superfamily结构域的序列比对结果显示（图9），相比于拟南芥和大豆的TOE家族AP2结构域^［42］，马铃薯的AP2和AP2 superfamily结构域更为保守，其核心功能区域的稳定性可能更高，也反映出该结构域在马铃薯生长发育、逆境响应等生物学过程中承担着不可替代的核心作用，是维持AP2/ERF超家族转录调控功能的关键基础。对‘华颂66’（紫皮紫肉）和‘大西洋’（黄皮白肉）马铃薯块茎不同生长发育时期qRT-PCR分析显示，StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5基因在‘华颂66’块茎形成期表达量最高，后呈下降趋势（图10）。已知紫色马铃薯的花青素积累始于块茎形成期（播种后约60 d），并在膨大期（第60—75天）快速上升^［43］。这一表达模式与花青素积累规律的关联性表明，StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5可能参与马铃薯块茎形成期的花青素合成过程，为后续紫色马铃薯块茎花青素的大量积累奠定了基础。后续应围绕StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5展开系统试验，重点探究该类基因调控马铃薯块茎花青素合成的途径与分子机制，以明确其具体调控模式。

4　结 论

基于紫肉马铃薯‘华颂66’和白肉马铃薯‘大西洋’块茎发育不同时期的测序结果，鉴定获得30个马铃薯AP2亚家族基因，划分为12个亚族，其中TOE3亚组共鉴定到6个马铃薯StTOE3基因，其启动子富含脱落酸和水杨酸响应元件，可能通过激素信号调控块茎花青素积累。RNA-seq分析和qRT-PCR验证结果发现，StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5在紫肉‘华颂66’块茎花青素快速积累的形成期显著高表达，与块茎花青素积累规律高度吻合，推测StTOE3‑1、StTOE3‑3和StTOE3‑5可能参与调控马铃薯块茎花青素的合成过程。

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基金资助

国家自然科学基金(32560141)

内蒙古科学技术研究院产业技术创新项目(2024RCYJ04004)

内蒙古自治区自然科学基金(2024QN03070)

内蒙古农业大学高层次及优秀博士人才引进科研启动项目(NDYB2022-48)