羊呼吸道主要病原的四重荧光定量PCR方法的建立

摘要

为建立1种能同时检测绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,Sp）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica,Mh）的四重荧光定量PCR检测方法。针对Pm的kmt1基因、Mh的lktD基因、Mo的tuf基因和Sp的yfhA基因设计引物及探针，建立同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR，并进行反应体系优化，使用该方法与地标PCR（DB 62/T 2686-2023、DB 51/T 2301-2016、DB 51/T 1302-2011、DB 22/T 2567-2016）检测法对采集的60份临床样品进行检测对比，验证该方法的灵敏度、特异性和重复性。结果表明，四重荧光定量PCR检测方法的标准曲线相关系数（R²）分别为0.999、0.997、0.999和0.999，且线性关系良好。Pm、Mh、Mo和Sp重组质粒最低检出限都达到1×10～2拷贝数/μL；四重qPCR反应的特异性良好；重复性试验结果的变异系数均在1%以下，具有良好的重复性。该方法检测Pm、Mh、Mo和Sp阳性率分别为50.0%、53.3%、11.7%、45.0%，与地标PCR检测的符合率为100.0%。综上，本研究成功构建了1种针对羊细菌性呼吸道疾病的四重实时荧光定量PCR检测体系，该方法特异性强、灵敏度高，可对羊呼吸道细菌病进行整体防控，减少其造成的经济损失。

关键词

多杀性巴氏杆菌 / 溶血性曼氏杆菌 / 绵羊肺炎支原体 / 肺炎链球菌 / TaqMan荧光定量PCR

基金资助

自治区天山创新团队计划项目（2025D14006）; 自治区天山英才青年拔尖托举人才项目（2023TSYCQNTJ0022）; 自治区重大科技专项项目（2023A02007-2）; 自治区重点研发项目（2024B02011）; 中央政府引导地方科技发展专项基金项目（ZYYD2024CG01）; 自治区乡村振兴产业发展科技行动项目（2025NC011）; 新疆农业大学大学生创新项目（dxscx2025129）