靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定

摘要

目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系，制备携带靶向人表皮生长因子受体2（HER2）蛋白的嵌合抗原受体（CAR）的细胞外囊泡（EV）,并检测其对HER2⁺肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000（PEG6000）浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析（NTA）和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2⁺肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明，提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论 通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2⁺肿瘤细胞。

关键词

嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞 / 同种异体 / 底盘细胞 / 细胞外囊泡