miR-207靶向自噬相关蛋白LAMP2调控巨噬细胞与结核分枝杆菌相互作用机制的研究

摘要

目的 miR-207被发现在自然杀伤(NK)细胞外泌体中表达，参与疾病进展，但暂无与结核病(TB)有关的研究。方法生物信息学方法预测并用双荧光素酶报告实验检测溶酶体关联膜蛋白2(LAMP2)是否与miR-207有靶向关系。使用脂质体转染法将实验分为四组(OP-LAMP2组：共转染miR-207 mimics和LAMP2过表达质粒；EP组：共转染mimics NC和空载质粒；siLAMP2组：转染siLAMP2; siLAMP2-NC组：转染siLAMP2-NC)。使用H37Ra感染Ana-1细胞建立结核感染模型。结核菌落形成单位计数评估LAMP2对胞内分枝杆菌负荷的影响以及对胞外残留分枝杆菌的清除作用。流式细胞术检测细胞总凋亡率。实时荧光定量PCR检测LAMP2、细胞凋亡基因、焦亡基因及自噬基因相对表达量。Western blot法检测LAMP2蛋白、细胞凋亡、焦亡、自噬蛋白的相对表达量。结果 双荧光素酶报告实验检测显示miR-207与LAMP2存在靶向关系，实时荧光定量PCR、Western blot结果统计分析和显微镜下观察证明成功建立感染模型。菌落形成单位计数发现OP-LAMP2组的菌落数低于EP组，siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。流式细胞术检测发现OP-LAMP2组总凋亡率低于EP组，siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。实时荧光定量PCR及Western blot法检测发现对照组凋亡、焦亡相关蛋白和基因相对表达量趋势为OP-LAMP2低于EP组，siLAMP2组高于siLAMP2-NC组。实时荧光定量PCR检测自噬正调节基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)和重组人自噬效应蛋白(Beclin1)在OP-LAMP2组相对表达量高于EP组，siLAMP2组低于siLAMP2-NC组，负调节自噬基因相对表达量与自噬正调节基因趋势相反。自噬相关蛋白相对表达量与自噬基因趋势一致。结论 miR-207通过靶向自噬相关蛋白LAMP2促进巨噬细胞凋亡、细胞焦亡、抑制自噬，促进结核分枝杆菌(Mtb)的存活，为TB提供新的治疗方向。

关键词

结核分枝杆菌(Mtb) / miR-207 / LAMP2 / 自噬 / 凋亡 / 焦亡