高糖刺激的GMC源外泌体促进足细胞焦亡及通络益肾方的干预研究

摘要

目的 观察高糖刺激的系膜细胞(GMC)源外泌体(Exo)对C57BL/6小鼠肾脏的影响及通络益肾方(TLYSF)的干预机制。方法 大鼠GMC分为正常糖组(NG,5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖),培养24 h后收集上清，超速离心法提取Exo,透射电镜及Western blot法鉴定Exo。C57BL/6雄性小鼠分为NO-Exo组、 NG-Exo组、 HG-Exo组，分别予以尾静脉注射PBS缓冲液、正常糖培养的GMC源Exo、高糖培养的GMC源Exo,每周3次，共8周。8周后，将HG-Exo组小鼠随机分为3组：HG-Exo组(生理盐水灌胃)、 HG-Exo联合TLYSF组[34.32 g/(kg·d)TLYSF灌胃],HG-Exo联合VAL组[10.4 mg/(kg·d)缬沙坦悬液灌胃],干预4周。检测尿微量白蛋白(mALb)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、糖化血红蛋白(HbA1c),血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN);透射电镜观察足细胞超微结构；TUNEL检测肾组织细胞DNA损伤情况；组织免疫荧光检测核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)及Wilms肿瘤蛋白1(WT-1)的表达；实时定量PCR检测NLRP3、半胱天冬酶1(caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)、 miR-200c-3p及miR-148a-3p mRNA的水平；Western blot法检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、 caspase-1及IL-1β蛋白的表达。结果 与NG-Exo组相比，HG-Exo组小鼠mALb、尿NAG、 Scr及BUN水平显著增加；透射电镜可见足细胞膜破裂、线粒体肿胀；TUNEL染色细胞阳性率升高，NLRP3光密度升高、 WT-1光密度下降；NLRP3、 caspase-1、 IL-1β mRNA及miR-200c-3p、 miR-148a-3p表达显著增加，NLRP3、 ASC、 caspase-1及IL-1β蛋白表达增加。与HG-Exo相比，HG-Exo联合TLYSF组小鼠mALb、尿NAG、 Scr及BUN水平降低，足细胞膜相对完整，线粒体损伤减轻；TUNEL染色细胞阳性率降低，NLRP3光密度下降，WT-1光密度上升，NLRP3、 caspase-1、 IL-1β、 miR-200c-3p、 miR-148a-3p mRNA水平均有不同程度的下降，NLRP3、 ASC、 caspase-1及IL-1β蛋白表达下降。结论 高糖刺激的GMC源Exo可损伤小鼠肾脏，诱导足细胞焦亡；TLYSF可能通过下调外泌体miR-200c-3p、 miR-148a-3p表达、抑制NLRP3/ASC/caspase-1通路活化而改善足细胞焦亡。

关键词

糖尿病肾病 / 通络益肾方(TLYSF) / 外泌体 / 细胞焦亡 / 微小RNA