龙胆苦苷通过调节肝星状细胞中MIF-SPP1信号通路预防巨噬细胞介导的肝纤维化机制研究

摘要

目的 探究龙胆苦苷（GPS）通过调节肝星状细胞中巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）-分泌型磷蛋白1（SPP1）信号通路预防巨噬细胞介导的肝纤维化机制。方法 将LX-2细胞分为对照组、转化生长因子β（TGF-β）组、 TGF-β联合GPS（25、 50、 100、 150）μmol/mL组，EDU检测细胞增殖、 Transwell^TM检测细胞侵袭、 Western blot法检测平滑肌激动蛋白（α-SMA）与一型胶原蛋白（COL1A1）蛋白表达。分离M1型巨噬细胞条件培养基（M1-CM）用于处理TGF-β组、 TGF-β联合GPS组LX-2细胞，同时检测细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、精氨酸酶1（Arg1）浓度，细胞增殖与侵袭能力，以及α-SMA与COL1A1蛋白表达。生物信息学分析GPS、肝纤维化与巨噬细胞相关基因的靶点交集，药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）实验和Western blot法验证GPS对MIF的调控作用。进一步将LX-2细胞分为对照组、 TGF-β组、 TGF-β联合M2-CM组、 TGF-β和oe-NC联合M2-CM组、 TGF-β和oe-MIF联合M2-CM组，分析细胞上清液iNOS、 Arg1浓度及细胞增殖、侵袭、 α-SMA与COL1A1蛋白表达变化。将LX-2细胞分为对照组、 TGF-β组、 TGF-β联合oe-NC组、 TGF-β联合oe-MIF组、 TGF-β和oe-MIF联合GPS组，Western blot法测定MIF与SPP1蛋白表达。构建大鼠肝纤维化模型，探究GPS对体内肝纤维化的潜在治疗作用。结果 与对照组相比，TGF-β组LX-2细胞增殖与侵袭能力增加，α-SMA与COL1A1蛋白表达增强，而GPS干预能够抑制TGF-β条件LX-2细胞增殖与侵袭，并降低α-SMA与COL1A1蛋白表达。与对照组相比，TGF-β组细胞上清液中iNOS浓度上调、 Arg1浓度下降，并且M1-CM处理在TGF-β干预的基础上，进一步增加了iNOS浓度、降低了Arg1浓度，同时促进了细胞增殖与侵袭，上调了α-SMA与COL1A1蛋白表达，而GPS能够逆转M1-CM干预的结果。生物信息学分析发现MIF为GPS、肝纤维化与巨噬细胞相关基因的靶点交集之一，且GPS能够靶向并抑制其表达。相比于TGF-β组，M2-CM干预后细胞上清液中iNOS浓度下降、 Arg1浓度增加，LX-2细胞增殖与侵袭能力降低，α-SMA与COL1A1蛋白表达减弱，然而过表达MIF后，逆转了M2-CM的干预效果。Western blot结果显示，相比于对照组，TGF-β组MIF与SPP1蛋白表达增强，过表达MIF后MIF与SPP1蛋白表达进一步增强，而GPS干预则抑制了MIF与SPP1蛋白表达。动物实验中，GPS干预治疗能够减轻肝纤维化大鼠肝损伤，并抑制肝组织中MIF与SPP1、 α-SMA与COL1A1蛋白表达。结论 GPS可能通过抑制肝星状细胞中MIF-SPP1信号通路预防巨噬细胞介导的肝纤维化。

关键词

巨噬细胞 / 龙胆苦苷(GPS) / 肝星状细胞 / 肝纤维化 / 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) / 分泌型磷蛋白1(SPP1)