FUNDC1蛋白酪氨酸磷酸化位点突变质粒对心肌H9c2细胞线粒体自噬的影响

摘要

目的 本研究采用定点突变的方法构建FUN14域蛋白1(FUNDC1)Y11和Y18酪氨酸位点突变质粒，探究FUNDC1蛋白酪氨酸磷酸化位点突变质粒对心肌H9c2细胞线粒体自噬的影响。方法 将使用全基因合成方法构建的突变质粒转染大鼠心肌H9c2细胞，实验分成空质粒组、 FUNDC1过表达组、突变Y11组、突变Y18组和突变Y11联合Y18组五组。利用CCK-8法检测H9c2细胞活力；利用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)检测线粒体膜电位；采用Western blot法检测细胞FUNDC1、线粒体转运孔蛋白20(TOM20)、内膜蛋白细胞色素C氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ)的蛋白表达水平；利用共聚焦显微镜确定转染效率以及线粒体、溶酶体共定位的情况。结果 成功构建FUNDC1过表达、 Y11、 Y18、 Y11联合Y18位点突变质粒；质粒转染细胞后共聚焦显微镜观察可见GFP荧光广泛表达。与空质粒组相比，FUNDC1过表达、 Y11、 Y18、 Y11联合Y18组FUNDC1蛋白表达水平明显上升，细胞活力及线粒体膜电位无明显变化。与空质粒组相比，转染Y18、 Y11联合18突变质粒的细胞TOM20、 COXⅣ的表达水平上升，线粒体溶酶体共定位减少。结论 转染FUNDC1 Y18或Y11联合Y18突变质粒，抑制心肌H9c2细胞的线粒体自噬。

关键词

线粒体自噬 / 基因定点突变 / FUNDC1 / H9c2细胞