KLF9调控巨噬细胞体内IFN-β表达的机制

摘要

目的 明确锌指蛋白Krüppel样转录因子9（KLF9）在Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV-1）诱导巨噬细胞Ⅰ型干扰素表达中的作用及机制。方法 通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR及Western blot法检测KLF9在Klf9^-/-（gKO）小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）中的敲除效果；RNA-seq筛选gKO小鼠及对照小鼠Klf9^+/+（WT）BMDM中HSV-1刺激后Klf9下游关键差异基因；实时荧光定量PCR验证HSV-1刺激后干扰素β1（Ifnb1）及下游干扰素刺激基因（ISG）如干扰素诱导蛋白与四肽重复1（Ifit1）、干扰素刺激的核酸外切酶基因20（Isg20）、胆固醇25-羟化酶（Ch25h）及2′-5′-寡聚腺苷酸合成酶1（Oasl1）的表达情况；ELISA检测HSV-1刺激后gKO及WT小鼠BMDM上清中β干扰素（IFN-β）的含量；Western blot法检测HSV-1刺激后gKO及WT小鼠BMDM中磷酸化干扰素调节因子3（p-IRF3）、干扰素调节因子3（IRF3）,p-IRF7、IRF7,磷酸化的核因子κB p65（p-NF-κB p65）、核因子κB p65（NF-κB p65）的表达；CUT-Tag及ChIP-qPCR技术检测KLF9在Ifnb1上的结合。结果 KLF9在gKO小鼠的BMDM中表达明显减少；RNA-seq结果显示BMDM中Klf9缺失导致Ⅰ型干扰素信号通路受损；实时荧光定量PCR结果表明Klf9敲除后BMDM中除了Isg20以外，Ifit1、Ch25h及Oasl1表达均明显降低；ELISA结果显示Klf9敲除导致BMDM分泌的IFN-β明显减少。在机制研究方面，Western blot法检测结果显示Klf9的缺失不影响p-IRF3、p-IRF7及p-NF-κB p65的表达；CUT-Tag及ChIP-qPCR结果显示KLF9能直接结合至Ifnb1的启动子区。结论 KLF9对巨噬细胞抵抗HSV-1感染至关重要。

关键词

骨髓来源的巨噬细胞(BMDM) / 锌指蛋白Krüppel样转录因子9(KLF9) / Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1) / IFN-β