二甲双胍-脂肪间充质干细胞外泌体复合物调控巨噬细胞极化进而改善肝缺血再灌注损伤的分子机制研究

摘要

目的 本研究旨在探讨二甲双胍（Met）-脂肪间充质干细胞外泌体（ADSC-Exo）复合物（Met-Exo）对肝缺血再灌注损伤的保护作用及其机制是否与沉默信息调节因子1（SIRT1）、基质金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP3）轴相关。方法 构建Met-Exo并通过纳米粒径分析、 Western blot法和透射电子显微镜（TEM）技术验证。采用体外模拟肝缺血再灌注损伤的小鼠肝细胞（AML12）模型，通过分析细胞活力、凋亡和肝功能指标[小鼠天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）],评估Met-Exo、 ADSC-Exo及Met对细胞损伤的保护效果。利用Transwell^TM共培养系统研究巨噬细胞极化对AML12细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤的影响。进一步将AML12细胞分为不同处理组，包括Ctrl组、 OGD/R组、 Met组、 ADSC-Exo组、 Met-Exo组，以及巨噬细胞极化相关实验组（M0、 M1、 M1联合Met-Exo组、 M1联合pcDNA3.1、 M1联合pcDNA3.1/SIRT1、 M1联合pcDNA3.1/TIMP3）。通过Western blot法检测各组AML12细胞中SIRT1和TIMP3蛋白的表达水平，同时检测巨噬细胞极化标志物诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg1）的浓度变化，以及AML12细胞的活力、凋亡情况和肝功能指标（AST和ALT）。构建肝缺血再灌注小鼠模型，Met-Exo干预治疗并评估治疗效果。结果 本研究成功制备出Met-Exo。体外实验表明Met-Exo能够改善OGD/R导致的肝细胞损伤，包括提升细胞活力、抑制细胞凋亡，降低AST、 ALT水平。并且Met-Exo预处理能够抑制M1型巨噬细胞标志iNOS的表达，促进M2型巨噬细胞标志Arg1的表达，进而减轻AML12细胞的OGD/R损伤。此外，OGD/R处理显著降低了AML12细胞中SIRT1和TIMP3蛋白的表达，而Met-Exo预处理有效上调了SIRT1蛋白的表达，进而可能促进TIMP3的表达。在巨噬细胞极化实验中，M1极化状态下的巨噬细胞加剧了AML12细胞的OGD/R损伤，表现为SIRT1和TIMP3蛋白表达下降，iNOS水平增加，Arg1水平下降，以及AML12细胞活力减弱、凋亡增加和肝功能指标上升。然而，通过过表达SIRT1或TIMP3,能够逆转这些不利影响，表现为巨噬细胞向M2型极化，AML12细胞损伤减轻。动物实验证实Met-Exo能够抑制小鼠肝缺血再灌注损伤。结论 Met-Exo通过上调SIRT1-TIMP3轴调控巨噬细胞向M2型极化从而减轻AML12细胞在OGD/R损伤中的炎症反应和细胞凋亡，达到保护肝脏的效果。

关键词

肝缺血再灌注损伤 / 二甲双胍(Met) / 脂肪间充质干细胞外泌体(ADSC-Exo) / 二甲双胍-脂肪间充质干细胞外泌体复合物 / 沉默信息调节因子1(SIRT1) / 基质金属蛋白酶组织抑制剂3(TIMP3)