靶向Tim-3哺乳动物细胞抗体库的构建、筛选及抗体功能研究

摘要

目的 T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（Tim-3）在天然免疫应答及适应性免疫应答调控中起关键作用，被视为新的免疫治疗靶点。本研究旨在实验室原有靶向人Tim-3的鼠源抗体基础上，借助计算机辅助分子设计，构建靶向人Tim-3的哺乳动物细胞抗体库，并筛选出功能改进的抗体。方法 整合计算机辅助分子模型构建平台与哺乳动物细胞抗体库技术，对Tim-3母本序列进行设计优化；通过Overlap PCR、载体的酶切、酶连与转化等分子生物学技术，得到靶向Tim-3哺乳动物抗体库的质粒库；通过测序比对获得全新序列抗体，利用ELISA技术进行筛选，获得表达量高、亲和力高的抗体；进一步通过体外功能实验（实时定量PCR、 CCK-8）验证优化抗体的功能。结果 以实验室前期制备的抗人Tim-3鼠源抗体为母本，利用计算机辅助设计平台，在Tim-3轻链与重链分别设计引入5个关键氨基酸替换；通过Overlap PCR分别获得3个含有突变碱基的轻链（L-1、 L-2、 L-3）和重链（H-1、 H-2、 H-3）,连接载体后转化入TOP10电转感受态细胞，成功构建富含序列多样性的抗体分子质粒库。对新抗体进行序列的分析比对，筛选并纯化得到亲和力高于母本的抗体，命名为1号抗体。实时定量PCR检测表明，1号抗体阻断巨噬细胞系RAW264.7细胞和小胶质细胞系BV2细胞后，β干扰素（IFN-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、 IL-6的基因转录水平明显上调；阻断Jurkat^Tim-3-high细胞后，IL-2、 IFN-γ的基因转录水平明显上调，且1号抗体的阻断作用大于母本Tim-3抗体。CCK-8法检测证明了1号抗体促进Jurkat^Tim-3-high细胞的增殖，且1号抗体的促进作用大于母本Tim-3抗体。结论 通过计算机辅助分子设计平台和哺乳动物抗体库技术，得到亲和力高于母本抗体、且能够提高人和小鼠细胞系多种细胞因子表达的全新序列的Tim-3人源抗体。

关键词

T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3) / 哺乳动物细胞抗体库 / 计算机辅助分子设计