基于CRISPR-AaCas12b的结核分枝杆菌核酸检测方法建立及临床初步评价

摘要

目的 结核分枝杆菌(Mtb)可通过免疫逃逸介导潜伏感染与低菌量感染，传统病原学及免疫学检测方法难以实现早期、灵敏、特异的精准诊断，本研究通过构建成簇的规律间隔短回文重复序列相关蛋白(CRISPR-Cas)检测体系，评估其对结核病(TB)的诊断效能，旨在为其早期分子诊断及免疫相关隐匿感染的识别提供新策略。方法 构建重组嗜酸脂环酸芽孢杆菌CRISPR-Cas12b蛋白(AaCas12b)表达载体并转化至感受态细胞，采用低浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)低温诱导策略实现重组AaCas12b的可溶性表达，结合镍柱亲和层析纯化工艺建立蛋白制备体系；靶向Mtb特异性插入序列IS6110建立重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)方法，体外转录合成其特异性单链向导RNA (sgRNA),进而构建CRISPR检测体系，并与抗酸染色、 T-SPOT.TB试验、分枝杆菌培养及GeneXpert检测技术等临床常用诊断方法比较，系统评估其在TB诊断中的应用。结果 本研究建立了重组蛋白原核表达与纯化体系，获得具有核酸切割活性的AaCas12b蛋白，浓度13.42 mg/mL,回收率61.45%;靶向IS6110序列建立了RPA-CRISPR-AaCas12b特异性检测体系，对Mtb检测下限(LOD)达1.5 CFU/mL。在临床样本验证中，该体系诊断TB灵敏度达95.83%(95%CI:79.97%～99.27%),特异度为92.31%(95%CI:75.88%～97.88%),准确率为94.00%(95%CI:83.78%～97.93%)。结论 本研究建立的AaCas12b蛋白制备体系高效稳定，可提供低成本、高活性的工具蛋白；基于RPA-CRISPR-AaCas12b技术靶向IS6110构建的诊断TB平台具有良好的特异度与灵敏度，为后续深入开发TB快速诊断平台提供了技术参考与实验基础。

关键词

结核分枝杆菌(Mtb) / 结核病(TB) / CRISPR-AaCas12b / 表达与纯化 / 分子诊断

基金资助

国家重点研发计划(2022YFC2603705); 西京医院医务人员培养助推计划(XJZT24JC18)