利用人表皮干细胞3D生物打印皮肤组织的初步研究

摘要

目的：对利用人表皮干细胞（Human Epidermal stem cells，hESCs）进行3D生物打印的皮肤组织进行初步研究。方法：分离人皮肤样本的表皮层与真皮层，胰酶消化，快速贴壁法分离ESCs，细胞免疫荧光染色及流式细胞仪鉴定其标志分子；MTT法检测完全DMEM培养基、无血清KGM2培养基中ESCs增殖情况；制备3D打印支架材料，以ESCs为种子细胞，采用微挤压3D生物打印技术打印皮肤组织，HE染色观察不同ESCs浓度的3D打印皮肤组织厚度，MTT法检测不同纤维蛋白原浓度对3D打印皮肤组织中细胞活性的影响；HE染色、免疫荧光染色观察3D打印皮肤组织的结构；透皮水分散失（Transepidermal water loss，TEWL）法、甲苯胺蓝渗透法检测3D打印皮肤组织的屏障功能。结果：细胞免疫荧光染色显示，第2代ESCs中β₁整合素、角蛋白19阳性表达率>90%；流式细胞仪检测显示，CD71低表达的同时α6整合素高表达的细胞>90%。与完全DMEM培养基比较，ESCs在无血清KGM2培养基中的组24、48、72 h吸光度值均升高（P<0.05）。与2×10～6/ml比较，4×10～6/ml、6×10～6/ml时打印组织厚度增加，4×10～6/ml、6×10～6/ml打印组织厚度比较，差异无统计学意义（P>0.05），选用4×10～6/ml作为后续ESCs浓度用于打印皮肤。当纤维蛋白原作为支架材料，浓度为5～20 mg/ml时，对ESCs的活性无明显影响。免疫荧光染色显示，3D打印皮肤组织的表皮层、真皮层分层良好。正常皮肤、3D打印皮肤的表皮层厚度、TEWL值、甲苯胺蓝的渗透厚度比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：以人ESCs作为种子细胞，培养于无血清KGM2培养基，5 mg/ml纤维蛋白原作为支架材料，微挤压3D生物打印技术打印皮肤组织，获取的皮肤组织与正常皮肤具有类似的表皮层厚度与屏障功能。

关键词

人表皮干细胞(hESCs) / 3D生物打印 / 生物医学工程 / 皮肤组织 / 屏障功能

基金资助

2023年度资阳市医学科学课题项目(编号：KY2023008)