RAS突变的幼年型粒单核细胞白血病患儿遗传学特点和临床分析

Genetic and clinical characteristics of children with RAS-mutated juvenile myelomonocytic leukemia

摘要

目的 探讨伴有RAS突变的幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia, JMML）的基因组特征和预后因素。方法 回顾性分析2008年1月—2022年11月中国医学科学院血液病医院诊治的具有RAS突变的JMML患儿的临床资料。结果 共纳入34例患儿，其中单纯NRAS突变17例（50%），单纯KRAS突变9例（27%），复合突变8例（24%）。与NRAS单纯突变的患儿比较，NRAS复合突变的患儿发病年龄、血小板计数及胎儿血红蛋白比例等方面差异有统计学意义（P<0.05）。Cox比例风险回归模型分析显示，造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）和肝大（≥肋下2 cm）是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素（P<0.05）；肝大是影响非HSCT组JMML患儿生存率的因素（P<0.05）。结论 NRAS复合突变患儿发病年龄晚于NRAS单纯突变患儿。NRAS复合突变患儿在初诊时，外周血小板和胎儿血红蛋白情况较NRAS单纯突变患儿更差。初诊时肝脏大小与RAS突变JMML患儿预后有关。HSCT可改善RAS突变JMML患儿预后。[中国当代儿科杂志，2025,27 (5):548-554]

Abstract

Objective To investigate the genomic characteristics and prognostic factors of juvenile myelomonocytic leukemia (JMML) with RAS mutations. Methods A retrospective analysis was conducted on the clinical data of JMML children with RAS mutations treated at the Hematology Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences, from January 2008 to November 2022. Results A total of 34 children were included, with 17 cases (50%) having isolated NRAS mutations, 9 cases (27%) having isolated KRAS mutations, and 8 cases (24%) having compound mutations. Compared to children with isolated NRAS mutations, those with NRAS compound mutations showed statistically significant differences in age at onset, platelet count, and fetal hemoglobin proportion (P<0.05). Cox proportional hazards regression model analysis revealed that hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and hepatomegaly (≥2 cm below the costal margin) were factors affecting the survival rate of JMML children with RAS mutations (P<0.05); hepatomegaly was a factor affecting survival in the non-HSCT group (P<0.05). Conclusions Children with NRAS compound mutations have a later onset age compared to those with isolated NRAS mutations. At initial diagnosis, children with NRAS compound mutations have poorer peripheral platelet and fetal hemoglobin levels than those with isolated NRAS mutations. Liver size at initial diagnosis is related to the prognosis of JMML children with RAS mutations. HSCT can improve the prognosis of JMML children with RAS mutations.

关键词

幼年型粒单核细胞白血病 / 临床特征 / 预后 / RAS突变 / 儿童

Key words

Juvenile myelomonocytic leukemia / Clinical feature / Prognosis / RAS mutation / Child

幼年型粒单核细胞白血病（juvenile myelomonocytic leukemia, JMML）是好发于婴幼儿期的罕见克隆性血液系统恶性肿瘤，表现为外周血单核细胞明显增高，骨髓和肝脾异常粒单核细胞浸润^［1］。绝大多数JMML患儿存在RAS/MAPK信号通路相关基因变异^［2］。异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）是目前JMML的唯一治愈性方法，但由于移植后复发率高及严重并发症发生率高，其长期生存率仅为50%^［3］。JMML是由于RAS/MAPK通路信号转导异常和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）所引起，导致血液系统恶性克隆对GM-CSF敏感性增加^［4］。根据目前发表的最大的3个JMML临床队列，在408例JMML患儿（欧洲175例、日本135例、北美98例）中，380例（93%）的JMML患儿携带RAS/MAPK信号通路基因突变，包括PTPN11、NF1、CBL、NRAS、KRAS基因的胚系或体细胞突变。NRAS突变和KRAS突变都是典型的肿瘤相关RAS突变，NRAS突变通常发生于G12、G13或G61位点，KRAS突变通常发生于G12和G13位点^［5-6］。RAS突变导致RAS蛋白及下游通路异常激活，从而导致疾病发生^［7］，这两种突变是JMML临床上较为常见的突变基因类型，但临床特征及疾病进展、转归具有一定异质性，目前研究尚有限。故本研究回顾性分析了具有RAS突变JMML患儿的遗传学特点与临床特征，旨在探索RAS突变JMML的基因组学特征与预后因素。

1 资料与方法

1.1　研究对象

回顾性分析2008年1月—2022年11月在中国医学科学院血液病医院诊治的具有RAS突变JMML患儿的临床资料。纳入标准：（1）符合2016版世界卫生组织的JMML诊断标准^［8］的初诊患者；（2）年龄0~14岁；（3）携带NRAS和/或KRAS基因突变。排除标准：（1）排除其他克隆性血液系统恶性肿瘤，如骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病等；（2）排除其他引起外周血单核细胞增高的疾病，如单核细胞增多症；（3）排除其他肿瘤，如淋巴瘤、消化系统肿瘤等；（4）排除JMML转化为其他髓系肿瘤的患者。本研究获得中国医学科学院血液病医院伦理委员会的批准（伦理审批号：IIT2021-EC-1），且所有患儿及家属均知情同意。

1.2　研究方法

1.2.1　基因检测方法

纳入的患儿均完成JMML突变基因检测，其中18例完成JMML经典基因热点突变检测，16例进行血液肿瘤基因组二代测序（next-generation sequencing, NGS）检测。热点突变检测方法：取患儿骨髓4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，根据基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，并将DNA标本进行PCR扩增。选取目的基因为JMML 5个经典基因，包括PTPN11（外显子2、3、4、7、8、12、13、14）、NRAS（外显子2、3、8、9）、KRAS（外显子2）、NF1（外显子35）和CBL基因。构建针对JMML 5个经典基因文库。NGS方法：提取患儿骨髓标本中基因组DNA，采用NGS方法检测血液肿瘤相关的112个基因编码区的点突变和插入/缺失突变，平均测序深度为2 000×。对携带JMML经典基因突变的患儿使用一代测序法检测口腔黏膜DNA进行验证，以确定是胚系或体细胞突变。

1.2.2　核型检测方法

采用G显带法进行骨髓染色体核型分析，采用荧光原位杂交对部分异常染色体核型进行验证。

1.2.3　甲基化测序方法

使用Illumina Infinium methylation EPIC Beadchip平台（Illumina）对DNA甲基化进行定量。所有JMML样本中可变CpG位点分为3个等级，分别为低甲基化、中甲基化和高甲基化。

1.2.4　随访

通过查阅患儿电子病历（住院病历和门诊病历）及电话随访，随访截止日期为2023年1月30日或患儿死亡。随访主要内容包括患儿性别、年龄、实验室检查、基因检测、治疗情况、生存情况和复发情况。

1.3　统计学分析

使用SPSS 22.0软件对数据进行处理。分类变量以百分率（%）或构成比表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。计量资料以中位数（范围）表示，采用非参数秩和检验Mann-Whitney U检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。将单因素Cox比例风险回归分析中P<0.10的所有变量纳入多因素Cox比例风险回归模型。采用多因素Cox比例风险回归模型分析JMML患儿预后的影响因素。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1　一般特征

本研究共纳入34例患儿，中位发病年龄14个月（范围：3~60个月），男女性别比为3.86∶1。RAS突变的JMML患儿均存在脾大，中位脾脏大小为肋下5 cm（范围：2~16 cm）。与NRAS单纯突变的患儿比较，NRAS复合突变的患儿发病年龄更大、血小板计数（platelet count, PLT）更低、胎儿血红蛋白（fetal hemoglobin, HbF）更高，差异有统计学意义（均P<0.001）。见表1。1例NRAS合并KRAS复合突变的患儿发病年龄为31个月，女性，初诊时脾脏大小肋下3 cm，肝脏大小肋下1 cm，WBC计数42.5×10⁹/L，血红蛋白（hemoglobin, Hb）69 g/L，PLT 73×10⁹/L，HbF 2%。

11例患儿（32%）行HSCT治疗，均为半相合HSCT，其中NRAS单纯突变者3例，NRAS复合突变2例，KRAS单纯突变者3例，KRAS复合突变3例。23例患儿（68%）未行HSCT治疗。

2.2　遗传及分子学特征

纳入的34例患儿中，携带NRAS单纯突变17例（50%），KRAS单纯突变9例（27%），NRAS合并PTPN11突变3例（9%），KRAS合并PTPN11突变2例（6%），NRAS合并KRAS突变1例（3%），KRAS、PTPN11和NF1复合突变1例（3%），NRAS、PTPN11和NF1复合突变1例（3%）。继发突变有EP300（2例），以及FAT1、TET2、FAN46C、JAK3、TRAF3、NOTCH1、IL7R、IKZF1和ARID1A（各1例）。

共28例患儿完成染色体核型检测，其中19例为NRAS突变，8例为KRAS突变，1例为NRAS合并KRAS突变。19例NRAS突变患儿中有2例为单体7核型，1例为其他异常核型，16例无核型异常。8例KRAS突变患儿中有1例为其他异常核型，7例无核型异常。1例NRAS合并KRAS突变患儿为其他异常核型。

共11例患儿完成DNA甲基化水平检测（8例为NRAS突变患儿，2例为KRAS突变患儿，1例为NRAS合并KRAS复合突变患儿）。8例NRAS突变患儿中，4例为中甲基化水平，4例为高甲基化水平。2例KRAS突变患儿中，1例为中甲基化水平，1例为高甲基化水平。1例NRAS合并KRAS复合突变患儿为高甲基化水平。

18例NRAS突变患儿完成突变位点检测，其中G12D位点突变4例（22%），G13D、G12S、G13A位点突变各3例（17%），Q61H、Q61R、G12A、Q61K、G13D合并Q61H位点突变各1例（6%）。10例KRAS突变患儿完成突变位点检测，其中G13D位点突变5例（50%），G12A、G12V、G60V、G21D、A59T合并T56I位点突变各1例（10%）。见图1。

2.3　生存分析

2.3.1　总体生存情况及生存分析

34例具有RAS突变的JMML患儿2年总体生存（overall survival, OS）率为43%±11%，NRAS突变组2年OS率为33%±14%，KRAS突变组2年OS率为46%±18%。中位生存期为11.5个月（范围：1~102个月），中位随访时间13个月（范围：1~102个月）。纳入患儿共死亡15例，其中13例未行HSCT治疗，均死于疾病进展；2例行HSCT治疗后死亡，1例于HSCT后8个月死于肺部感染，1例死于HSCT后排异反应。

行HSCT治疗的患者OS率显著优于未行HSCT治疗的患者（82%±10% vs 44%±12%，P=0.037）。NRAS HSCT组的患儿OS率高于NRAS非HSCT组（80%±8% vs 47%±13%，P=0.031），KRAS HSCT组的患儿OS率高于KRAS未HSCT组（83%±9% vs 33%±10%，P=0.044），见图2B。NRAS单纯突变、NRAS复合突变、KRAS单纯突变和KRAS复合突变患儿生存曲线见图2C。

2.3.2　影响RAS突变的JMML患儿的单因素及多因素分析

在纳入的RAS突变患儿当中，单因素Cox分析显示，行HSCT治疗是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素（P=0.035）。多因素Cox分析显示，行HSCT治疗（P=0.009）和肝大（≥肋下2 cm，P=0.018）是影响RAS突变的JMML患儿生存率的因素。见表2。

在未行HSCT治疗的RAS突变患儿当中，单因素Cox分析显示，肝大、初诊PLT<40×10⁹/L是影响未行HSCT的RAS突变的JMML患儿生存率的因素（P<0.05）。多因素Cox比例风险回归模型分析结果显示，肝大是影响未行HSCT的RAS突变的JMML患儿生存率的因素（P<0.05）。见表2。

3 讨论

JMML是一种婴幼儿罕见的造血干细胞克隆性疾病，以粒系及单核系细胞异常增殖为特征，并常伴红系与巨核系发育异常^［9］。JMML临床表现异质性较大，通常表现为发热、乏力、脾大和血小板减少^［10］。本研究中携带RAS突变的JMML患儿主要以肝脾大为最常见临床症状和体征。本研究发现NRAS复合突变的患儿发病年龄显著大于NRAS单纯突变患儿，并且外周血PLT和HbF等情况较NRAS单纯突变患儿差。根据既往研究报道的预后因素，提示本研究中的NRAS复合突变的患儿携带较多预后不良因素，其预后应该差于NRAS单纯突变患儿。但本研究中发现两组患儿之间的预后并无显著性差异，这可能与本研究纳入的患儿时间跨度大，早期并没有规范成熟的治疗方案有关^［4］。

近年来，JMML基因组学和表观遗传学研究取得了重大进展。基因突变的发现有助于提高诊断准确性，预测患儿临床预后，并给予最佳治疗策略^［11］。JMML的发病机制与RAS/MAPK通路基因突变相关。根据目前的研究，90%以上的JMML患儿可检测出JMML经典基因突变，包括PTPN11、NF1、CBL、NRAS、KRAS基因突变^［12］。既往研究发现，JMML中NRAS突变和KRAS突变患儿数大致相当^［13］，但本研究中NRAS患儿占比相较于既往报道偏高，可能与早期患儿采取一代测序，遗漏部分突变位点有关。

由于JMML恶性程度高，进展迅速，如果不及时治疗，多数患儿死于疾病进展或继发感染。并且JMML患儿对化疗反应差，目前尚未发现有效的化疗药物^［14］。本研究中RAS突变的JMML患儿2年OS率为43%±11%，最常见的死亡原因是疾病进展和继发感染。有研究发现某些NRAS突变的JMML患者可自发缓解并且在未行HSCT治疗的情况下长期存活^［15］。但对于大部分携带NRAS突变以及所有携带KRAS突变的JMML患儿建议诊断明确后应立即行HSCT治疗^［16］。

既往研究提示JMML患者初诊年龄≥24个月，PLT计数<40×10⁹/L、HbF增高为预后不良因素^［17］。在本研究中发现肝脏≥肋下2 cm是影响RAS突变的JMML预后的因素，这可能由于肝脏大小能反映JMML肿瘤负荷，肝脏越大代表肿瘤负荷越高，从而导致患儿预后不良。但本研究并未发现脾脏大小和RAS突变的JMML患儿预后之间存在关联，这可能是由于患儿初诊时年龄跨度大，不同年龄的儿童脾脏正常大小不同，并且同一年龄的正常儿童脾脏大小也可能不同^［18］。因此，对于不同的JMML患儿，脾脏肋缘下大小可能不能准确反映患儿的真实肿瘤负荷。

既往研究报道RAS突变的JMML患儿预后还可能与DNA甲基化水平相关^{［12，19］}。本研究中完成甲基化水平检测的患儿共11例，由于完成DNA甲基化水平检测的患儿太少，尚无法提供有力的甲基化水平影响JMML患儿生存的证据。本研究发现NRAS突变和KRAS突变的位点占比最高的为G12和G13位点的突变，与既往研究^［5］报道一致。既往研究报道KRAS突变的JMML通常存在单体7核型^［20］，但本研究中完成核型检测的KRAS突变患儿中并未发现单体7核型，这可能与样本量太小有关。

本研究病例资料是单中心数据，时间跨度大，且数量有限，这是本研究的不足之处。在早期病例中，由于对疾病认识不足，一些患者无法得到及时诊断，相关检查也并不完善。目前，JMML的诊断标准逐渐明确，医疗技术不断提高，对JMML的认识也在不断突破，JMML的诊断和治疗将更加准确和有效。

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基金资助

国家自然科学基金(82270144)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-003)

卫生健康发展促进项目-汇宇肿瘤研究基金项目(008)