FGF19通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻血管内皮细胞炎症损伤的机制研究

FGF19 alleviates inflammatory injury in vascular endothelial cells by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway

摘要

目的 探讨成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF） 19在高糖（high glucose, HG）导致的血管内皮细胞炎症损伤中的作用及其机制。方法 将人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）随机分为对照组、HG组、FGF19组、HG+FGF19组（n=3）。运用CCK8法检测不同浓度葡萄糖和/或FGF19对HUVEC细胞活力的影响，流式细胞术检测FGF19对HUVEC细胞凋亡的影响，ELISA法测定白细胞介素-6 (interleukin 6, IL-6)、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平，实时荧光定量PCR及Western blot法检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、红系衍生的核因子2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)、血红素加氧酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1) mRNA及蛋白表达水平；另取细胞分为对照组、siRNA-Nrf2 (siNrf2)组、HG组、HG+FGF19组、HG+FGF19+阴性对照组、HG+FGF19+siNrf2组（n=3），观察沉默Nrf2基因后FGF19对HG诱导的HUVEC氧化应激损伤的影响。结果 与对照组比较，HG组细胞凋亡率和IL-6、iNOS、MDA含量以及VEGF mRNA及蛋白表达升高（P<0.05）,T-SOD活力以及Nrf2、HO-1mRNA及蛋白表达降低（P<0.05）；与HG组比较，HG+FGF19组细胞凋亡率和IL-6、iNOS、MDA含量以及VEGF mRNA及蛋白表达降低（P<0.05）,T-SOD活力以及Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平升高（P<0.05）。与HG+FGF19+阴性对照组相比，HG+FGF19+siNrf2组T-SOD活力下降，MDA含量升高（P<0.05）。结论 FGF19可减轻HG导致的血管内皮细胞炎症损伤，其机制可能与Nrf2/HO-1信号通路有关。[中国当代儿科杂志，2025,27 (5):601-608]

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of fibroblast growth factor (FGF) 19 in inflammation-induced injury of vascular endothelial cells caused by high glucose (HG). Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were randomly divided into four groups: control, HG, FGF19, and HG+FGF19 (n=3 each). The effect of different concentrations of glucose and/or FGF19 on HUVEC viability was assessed using the CCK8 assay. Flow cytometry was utilized to examine the impact of FGF19 on HUVEC apoptosis. Levels of interleukin-6 (IL-6), inducible nitric oxide synthase (iNOS), total superoxide dismutase (T-SOD), and malondialdehyde (MDA) were measured by ELISA. Real-time quantitative PCR and Western blotting were used to determine the mRNA and protein expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2), and heme oxygenase-1 (HO-1). Cells were further divided into control, siRNA-Nrf2 (siNrf2), HG, HG+FGF19, HG+FGF19+negative control, and HG+FGF19+siNrf2 groups (n=3 each) to observe the effect of FGF19 on oxidative stress injury in HUVECs induced by high glucose after silencing the Nrf2 gene. Results Compared to the control group, the HG group exhibited increased apoptosis rate, increased IL-6, iNOS and MDA levels, and increased VEGF mRNA and protein expression, along with decreased T-SOD activity and decreased mRNA and protein expression of Nrf2 and HO-1 (P<0.05). Compared to the HG group, the HG+FGF19 group showed reduced apoptosis rate, decreased IL-6, iNOS and MDA levels, and decreased VEGF mRNA and protein expression, with increased T-SOD activity and increased Nrf2 and HO-1 mRNA and protein expression (P<0.05). Compared to the HG+FGF19+negative control group, the HG+FGF19+siNrf2 group had decreased T-SOD activity and increased MDA levels (P<0.05). Conclusions FGF19 can alleviate inflammation-induced injury in vascular endothelial cells caused by HG, potentially through the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

关键词

1型糖尿病 / 炎症 / 氧化应激 / 血管内皮功能障碍 / 成纤维细胞生长因子19 / 人脐静脉内皮细胞

Key words

Type 1 diabetes mellitus / Inflammation / Oxidative stress / Vascular endothelial dysfunction / Fibroblast growth factor19 / Human umbilical vein endothelial cell

1型糖尿病是严重危害儿童和青少年健康的慢性疾病之一，患者需终生依赖胰岛素控制血糖，给社会和家庭带来沉重负担。1型糖尿病往往以糖尿病性酮症酸中毒起病，糖尿病性酮症酸中毒可导致较高的急性肾损伤发生率^［1］。长期高糖（high glucose, HG）导致的慢性血管炎症是发生糖尿病血管病变的始发因素。糖尿病并发症一般分为微血管并发症和大血管并发症，有学者建议将糖尿病并发症分为血管并发症、器官实质并发症和混合并发症（兼具血管和实质病变特征）^［2］。糖尿病血管并发症的病理特征主要表现为内皮功能障碍和动脉粥样硬化^［3］。内皮细胞位于血液和组织之间，其所处微环境葡萄糖浓度随进食状态动态变化，内皮细胞通过摄取血液中的葡萄糖，经代谢转化或直接转运至血管壁及实质组织细胞。研究表明，葡萄糖诱导的内皮功能障碍在不同血管类型和不同血管床中存在差异；内皮葡萄糖代谢对细胞表型和功能至关重要；内皮细胞葡萄糖反应在动脉粥样硬化、癌症、阿尔茨海默病的微血管和大血管疾病中具有重要作用^［4-5］。因此逆转糖尿病血管内皮功能障碍成为预防血管并发症的关键。

氧化应激和炎症损伤在糖尿病微血管和大血管并发症的发生发展中起重要作用，其中，白细胞介素（interleukin, IL）-6、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase, T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）的异常表达参与了以上作用的发生^［6-7］。研究表明，红系衍生的核因子2相关因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2）/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）通路是调节氧化应激、炎症、细胞凋亡的重要途径^［8］。例如远端缺血调节具有保护脑组织的功能，其通过Nrf2/HO-1通路在脑组织缺血/再灌注损伤过程中发挥降低炎症因子IL-6、氧化应激指标MDA表达水平的作用^［9］。Nrf2/HO-1通路在糖尿病血管内皮损伤中的作用尚不明确。

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）19是一种新的内分泌调节因子，通过与成纤维细胞生长因子受体4和β-Klotho（一种跨膜蛋白）结合，激活下游信号通路，发挥调节葡萄糖和脂质代谢的作用^［10］。研究发现，FGF19通过刺激Nrf2表达、腺苷酸活化蛋白激酶信号通路减少活性氧的产生，从而诱导抗氧化反应^［11］。FGF19还可通过抑制糖原合成酶激酶-3β活性和促进Nrf2抗氧化反应元件信号激活，减轻缺氧和复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激^［12］。但FGF19对糖尿病血管内皮损伤的影响及其机制尚无相关研究。本研究拟探讨FGF19在高糖导致的血管内皮细胞损伤中的作用及机制，为改善糖尿病血管并发症提供新的理论依据。

1 材料和方法

1.1　实验材料

GAPDH、Nrf2抗体（武汉博士德生物公司）、VEGF抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司）、HO-1兔抗人单克隆抗体（美国Abcam公司）、RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）、原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）（上海中乔新舟生物科技有限公司）、riboFECT ^TM CP转染试剂盒（广州锐博生物技术有限公司）、人FGF19 ELISA试剂盒（上海普欣生物技术有限公司）、人IL-6、iNOS、VEGF、T-SOD ELISA试剂盒、CCK8试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（武汉普诺赛生命科技有限公司）、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2　细胞培养

将HUVEC置于含5.5 mmol/L葡萄糖、5%胎牛血清、细胞生长因子、青霉素-链霉素的内皮细胞培养基中，于37℃、5% CO₂培养箱中培养，每2~3 d传代一次，细胞生长状态良好，取对数生长期细胞进行实验。

1.3　CCK8法检测细胞活力

（1）观察不同浓度葡萄糖对HUVEC细胞活力的影响。设定葡萄糖浓度梯度为5.5、11、22、33、44 mmol/L。将细胞接种于96孔板中，每孔100 μL（5×10³个细胞）；仅加培养基的孔作为空白对照孔。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h。用酶标仪测定在450 nm处的光密度（optical density, OD）值。按说明书计算细胞活力，细胞活力=［OD（加药）-OD（空白）］/［OD（未加药）-OD（空白）］×100%。

（2）观察不同浓度FGF19对HUVEC细胞活力的影响。设定FGF19浓度梯度为0、12.5、25、50、100、200 ng/mL。将细胞接种于96孔板中，每孔100 μL（3×10³个细胞）；仅加培养基的孔作为空白对照孔。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK8溶液，继续培养2 h。用酶标仪检测在450 nm处的OD值，计算细胞活力。

（3）观察不同浓度FGF19对HG培养条件下HUVEC细胞活力影响。运用上述实验筛选出的葡萄糖浓度培养HUVEC。设定FGF19浓度梯度为0、12.5、25、50、100、200 ng/mL，仅加培养基的孔作为空白对照孔。按上述实验步骤检测并计算细胞活力。

1.4　流式细胞术检测细胞凋亡

实验分为对照组、HG组、FGF19组、HG+FGF19组（n=3）。将HUVEC细胞悬液1 mL（1.5×10⁵个细胞）接种在24孔板中。HG组、HG+FGF19组葡萄糖浓度为33 mmol/L，FGF19组、HG+FGF19组FGF19浓度为50 ng/mL，对照组加入相同体积的PBS。培养48 h后收集细胞，每组细胞中加入300 μL 1×Annexin V binding buffer工作液重悬细胞。分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶，室温避光孵育20 min，使用流式细胞仪检测。实验独立重复3次。

1.5　ELISA法检测IL-6、iNOS、T-SOD、MDA水平

按1.4分组处理细胞，收集各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤检测IL-6、iNOS、T-SOD、MDA水平。实验独立重复3次。

1.6　实时荧光定量PCR检测VEGF、Nrf2、HO-1 mRNA表达水平

按1.4分组处理细胞，收集各组细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，反应体系、反应条件参考2×通用型SYBR Green快速qPCR预混液说明书。采用2^-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR数值进行分析。实验独立重复3次。引物序列如下（5'→3'）：VEGF上游引物CTTGCCTTGCTGCTCTACCT，下游引物GACATCCATGAACTTCACCACTT；Nrf2上游引物CAACTACTCCCAGGTTGCCC，下游引物AGTGACTGAAACGTAGCCGAA；HO-1上游引物TCTTGGCTGGCTTCCTTACC，下游引物GGATGTGCTTTTCGTTGGGG；GAPDH上游引物AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

1.7　Western blot检测VEGF、Nrf2、HO-1蛋白表达水平

按1.4分组处理细胞，收集各组细胞，加入150 μL RIPA细胞裂解液，于冰上充分裂解，收集细胞上清液。取少量用BCA法测蛋白浓度，余加5×SDS-PAGE上样缓冲液煮沸4 min，-80℃保存。取等量蛋白行电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h，漂洗后加GAPDH、Nrf2、HO-1及VEGF一抗（稀释度均为1∶1 000），4℃孵育过夜；漂洗后加二抗（稀释度为1∶2 400），室温孵育1 h，漂洗后用化学发光法显色。采用Gel-Pro analyzer软件分析结果，以GAPDH为内参，目的蛋白/GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验独立重复3次。

1.8　验证细胞敲低效率

将细胞分为空白对照组、阴性对照组、干扰组。将HUVEC细胞悬液2 mL（2×10⁵个细胞）接种在6孔板中，细胞融合度达50%时，按riboFECT ^TM CP转染试剂盒说明书转染细胞。向1× riboFECT ^TM CP buffer中加入siRNA储存液，再加入riboFECT ^TM CP reagent，轻轻混匀，室温孵育10 min，制成转染复合物。向转染复合物中加入适量无青霉素-链霉素的完全培养基，干扰组加入含siRNA-Nrf2的转染试剂，阴性对照组加入含阴性对照siRNA的转染试剂，空白对照组不加任何转染试剂。培养48 h后检测Nrf2 mRNA及蛋白表达水平，验证敲低效率。实验独立重复3次。

1.9　沉默Nrf2基因后检测各组HUVEC T-SOD、MDA水平

实验分为对照组、siRNA-Nrf2（siNrf2）组、HG组、HG+FGF19组、HG+FGF19+阴性对照组、HG+FGF19+siNrf2组（n=3）。分组处理细胞后，采用ELISA法检测各组细胞上清液中T-SOD、MDA表达水平。实验独立重复3次。

1.10　统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差（ \overline{x} \pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，组间两两比较采用LSD检验；方差不齐时，组间两两比较采用盖姆斯-豪厄尔检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1　不同浓度葡萄糖和/或FGF19对HUVEC细胞活力的影响

经不同浓度葡萄糖（5.5、11、22、33、44 mmol/L）处理48 h后，HUVEC细胞活力分别为100.0%±3.1%、110.1%±1.9%、101.2%±2.1%、94.0%±1.1%、78.4%±4.3%；葡萄糖浓度为33、44 mmol/L时，HUVEC细胞活力较5.5 mmol/L组明显下降（P<0.05）。后续实验选择葡萄糖浓度为33 mmol/L。

FGF19浓度为0、12.5、25、50、100、200 ng/mL，HUVEC细胞活力分别为97.6%±3.8%、107.7%±3.6%、105.8%±2.0%、104.6%±2.4%、112.9%±1.0%、105.2%±3.4%，各浓度组HUVEC细胞活力均高于0 ng/mL组，差异具有统计学意义（F=8.68，P=0.001）。选择FGF19的工作浓度范围为12.5~200 ng/mL。

葡萄糖浓度为33 mmol/L，FGF19浓度为0、12.5、25、50、100、200 ng/mL时，HUVEC细胞活力分别为89.5%±2.1%、92.2%±5.8%、94.6%±6.6%、102.7%±3.0%、105.6%±6.9%、98.8%±2.3%，FGF19浓度≥50 ng/mL时，HUVEC细胞活力提高，后续实验采用FGF19浓度为50 ng/mL（F=4.90，P=0.01）。

2.2　FGF19对HG培养条件下HUVEC细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，对照组、HG组、FGF19组、HG+FGF19组细胞凋亡率分别为20.3%±2.7%、26.0%±2.5%、16.5%±2.6%、19.8%±0.9%，与对照组相比，HG组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）；与HG组相比，HG+FGF19组细胞凋亡率显著下降（P<0.01）。见图1。

2.3　FGF19对HUVEC细胞炎症及氧化应激指标的影响

与对照组相比，HG组IL-6、iNOS、MDA水平升高，细胞T-SOD活力降低（P<0.05）；与HG组相比，HG+FGF19组IL-6、iNOS、MDA水平降低，细胞T-SOD活力升高（P<0.05）。见表1。

2.4　FGF19对HUVEC VEGF、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白质表达的影响

与对照组相比，HG组VEGF mRNA及蛋白质表达水平升高，Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白质表达水平降低（P<0.05）；与HG组相比，HG+FGF19组VEGF mRNA及蛋白质表达水平降低，Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白质表达水平升高（P<0.05）。见表2、图2。

2.5　沉默Nrf2基因对HUVEC Nrf2 mRNA及蛋白表达水平的影响

实时荧光定量PCR及Western blot结果显示，与阴性对照组（分别为0.94±0.09、1.02±0.14）相比，siNrf2组（分别为0.66±0.14、0.66±0.07）Nrf2 mRNA及蛋白表达水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.6　沉默Nrf2基因对HUVEC T-SOD、MDA水平的影响

与对照组、siNrf2组、HG+FGF19组、HG+FGF19+阴性对照组相比，HG组T-SOD活力下降，MDA水平升高（P<0.05）；与HG+FGF19+阴性对照组相比，HG+FGF19+siNrf2组T-SOD活力下降，MDA水平升高（P<0.05）。见表3。

3 讨论

FGF是一大类蛋白质，对机体发育、器官发生和代谢具有多效性作用。FGF19及其啮齿类动物直系同源物FGF15及FGF21、FGF23均属于内分泌FGF亚家族^［13-14］。FGF19主要在小肠和结肠上皮细胞中表达，具有胰岛素样效应^［15-16］，并有增加胰岛素敏感性的作用^［17］。FGF19的降糖作用为非胰岛素依赖^［18］。FGF19可诱导抗氧化反应以及减轻缺氧、复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激^［19-20］。FGF19参与心肌细胞肥厚的发展和心肌脂肪酸代谢的调节^［21］。

健康的内皮细胞通过控制通透性、炎症、血管张力和损伤修复来维持血管稳态^［22］。然而，当内皮细胞暴露于HG或低糖环境时，将导致功能失调^［23］。葡萄糖诱导的内皮功能障碍与糖酵解途径下游的葡萄糖代谢增强有关。高血糖时大量的甲基乙二醛会产生晚期糖基化终末产物，其通过修饰细胞内蛋白分子对血管内皮细胞造成损伤^［24］。目前对于高血糖导致的血管内皮损伤还没有有效的治疗办法。本研究发现，FGF19可增加血管内皮细胞活力，改善HG导致的细胞活力降低，并降低HG导致的内皮细胞凋亡率。

糖尿病血管并发症往往始于内皮细胞的损伤，进而导致炎症因子及氧化应激指标的高表达。本研究发现，HG可导致IL-6、iNOS水平以及VEGF mRNA和蛋白表达升高，FGF19可使HG条件下HUVEC IL-6、iNOS水平以及VEGF mRNA和蛋白表达水平降低。氧化应激损伤是糖尿病血管并发症发生的重要因素，T-SOD是一类专门清除超氧阴离子自由基（O₂ ^–）的金属蛋白酶的总称，是机体抗氧化系统的重要组成部分，在对抗和清除活性氧（reactive oxygen species, ROS）中发挥了重要作用。本研究发现，HG组HUVEC的T-SOD活力下降，HG+FGF19组T-SOD活力明显提高。Li等^［25］研究发现，重组FGF21在治疗糖尿病角膜上皮损伤中可抑制ROS产生，增加抗炎分子IL-10和SOD-1水平，这表明FGF21通过增加抗氧化能力，减少炎症介质和基质金属蛋白酶的释放，在糖尿病角膜上皮愈合中发挥保护作用。MDA是脂质过氧化的终分解产物之一，能够引起细胞毒害作用，常被用作检测生物体中氧化应激水平的生物标志物，HG可促使内皮细胞MDA表达水平升高。有研究表明，FGF19能有效降低脓毒症患者血清MDA水平，减轻了氧化应激反应^［26］。本研究结果显示，FGF19能有效降低HG条件下HUVEC MDA水平，发挥抗氧化应激损伤的作用。

Nrf2/HO-1是调控氧化应激反应的重要通路，具有抗氧化、抗炎、减少细胞凋亡和抑制血管钙化等作用，能够抑制ROS产生，减少SOD消耗，抑制氧化损伤，延缓心血管疾病的发生发展^［27-29］。本研究发现，HG水平可降低HUVEC Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平，而加入FGF19可提高Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平。为了进一步明确FGF19是否通过Nrf2基因介导的通路发挥作用，运用siRNA干扰技术敲低Nrf2基因，结果显示，敲低Nrf2基因后FGF19提高HUVEC T-SOD活力的作用受抑制，MDA表达量增加。

综上所述，FGF19是一种新型的内分泌激素，具有保护血管内皮损伤的作用，其作用体现在提高细胞活力、减轻凋亡、抗炎及抗氧化应激损伤等方面，可能通过与Nrf2/HO-1通路的参与有关。本研究不足之处在于仅采用HUVEC为研究对象，不能完全模拟人体所有内皮细胞，尚需从动物体内实验及人体组织样本验证FGF19的作用，提供更加有力的证据。总之，越来越多的研究表明，FGF19具有改善葡萄糖和脂肪代谢，以及增加胰岛素敏感性的作用，对糖尿病及肥胖症具有治疗意义。FGF19类似物阿达非明已应用于脂肪性肝炎和糖尿病患者，具有良好的治疗作用^［30］。尽管如此，FGF19具有促进有丝分裂活性，长期给予FGF19可通过激活FGFR4促使肿瘤的发生^［31］，这就需要我们深入研究并开发更多FGF19类似物，筛选出疗效好、不良反应少的药物，造福于临床患者。

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基金资助

山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS038)