铜过载介导内质网应激在川崎病血管内皮损伤中的作用及机制研究

Role and mechanism of copper overload-mediated endoplasmic reticulum stress in vascular endothelial injury in Kawasaki disease

摘要

目的 探讨铜过载介导的内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）在川崎病（Kawasaki disease, KD）血管内皮损伤中的作用及机制。方法 将4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、KD组、KD+铜螯合剂四硫代钼酸盐（tetrathiomolybdate, TTM）组及KD+内质网应激抑制剂AMG PERK 44(AMG)组（每组n=20），使用白色念珠菌提取物构建KD小鼠模型；将人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）分为对照组（健康儿童血清干预）、KD组（KD患儿血清干预）、KD+TTM组（KD患儿血清联合20μmol/L TTM干预）。采用红氨酸铜染色检测小鼠心脏组织铜沉积情况，通过测量小鼠腹主动脉直径和面积、苏木精-伊红染色观察小鼠血管病理改变，透射电镜、免疫荧光检测ERS激活情况；采用CCK8、流式细胞术、细胞划痕和细胞成管实验评估HUVEC细胞活力、凋亡和功能改变，Western blot法检测ERS标志蛋白表达水平。结果 与KD组比较，KD+TTM组和KD+AMG组血管壁铜盐沉积减少，冠状动脉内皮细胞和内质网肿胀、炎性细胞浸润、腹主动脉病变扩张减轻；腹主动脉直径和面积、ERS标志蛋白（GRP78、CHOP）荧光强度降低（P<0.05）。与KD组比较，KD+TTM组细胞活力、小管数目、划痕愈合率升高，细胞凋亡率、ERS标志蛋白（GRP78、CHOP、ATF6和p-PERK）表达降低（P<0.05）。结论 铜过载通过激活ERS通路加重KD血管内皮损伤，TTM可通过调控铜代谢及抑制ERS通路发挥内皮保护作用。[中国当代儿科杂志，2025,27 (7):842-849]

Abstract

Objective To investigate the role and mechanism of copper overload-mediated endoplasmic reticulum stress (ERS) in vascular endothelial injury in Kawasaki disease (KD). Methods Four-week-old male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups: control, KD, KD plus copper chelator tetrathiomolybdate (TTM), and KD plus ERS inhibitor AMG PERK 44 (AMG) (n=20 per group). A KD mouse model was established using Candida albicans extract. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were divided into control (intervention with healthy children's serum), KD (intervention with KD patients' serum), and KD+TTM (intervention with KD patients' serum plus 20 µmol/L TTM). Copper deposition in mouse heart tissue was assessed using rubeanic acid staining. Vascular pathological changes were observed using hematoxylin-eosin staining and measurement of abdominal aortic diameter and area. ERS activation was detected by transmission electron microscopy and immunofluorescence. HUVEC viability, apoptosis, and functional changes were evaluated using CCK8, flow cytometry, cell scratch assay, and angiogenesis experiments. ERS marker protein expression levels were measured by Western blot. Results Compared to the KD group, the KD+TTM and KD+AMG groups showed reduced copper deposition in the vascular wall, decreased swelling of coronary endothelial cells and endoplasmic reticulum, reduced inflammatory cell infiltration, and less abdominal aortic lesion expansion. The abdominal aortic diameter and area, and the fluorescence intensity of ERS marker proteins (GRP78 and CHOP) were significantly lower (P<0.05). Compared to the KD group, the KD+TTM group exhibited increased cell viability, tube number, and scratch healing rate, along with decreased apoptosis rate and expression of ERS marker proteins (GRP78, CHOP, ATF6, and p-PERK) (P<0.05). Conclusions Copper overload aggravates vascular endothelial injury in KD by activating the ERS pathway. TTM can exert protective effects on the endothelium by regulating copper metabolism and inhibiting the ERS pathway.

Graphical abstract

关键词

川崎病 / 血管内皮损伤 / 内质网应激 / 铜螯合剂 / 人脐静脉内皮细胞 / 小鼠

Key words

Kawasaki disease / Vascular endothelial injury / Endoplasmic reticulum stress / Copper chelator / Human umbilical vein endothelial cell / Mouse

川崎病（Kawasaki disease, KD）是一种以全身性血管炎为特征的小儿急性发热性疾病。好发于5岁以下婴幼儿（占比>85%）^［1］。目前病因与发病机制尚未完全阐明，临床诊断主要依赖特征性临床表现结合实验室指标^［2］。未经治疗的患儿约20%可并发冠状动脉病变，为儿童时期最常见的获得性心脏病之一^［3］。

近年研究发现，KD血管损伤的核心机制与内皮功能障碍密切相关^［4］，而内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）在此过程中发挥关键调控作用，多种病理因素诱导的ERS可通过激活未折叠蛋白反应，触发肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1, IRE1）、蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK）及激活转录因子6（activating transcription factor 6, ATF6）信号通路级联反应。静息状态下，IRE1α、PERK和ATF6与分子伴侣葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78, GRP78）结合；当内质网稳态破坏时，GRP78发生移位，从而激活下游CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT enhance-binding protein homologous protein, CHOP），导致氧化应激、炎症级联反应和细胞凋亡等病理过程，最终加剧内皮损伤^［5］。因此，靶向调控ERS信号网络被认为是改善心血管疾病预后的潜在策略。

在金属离子调控体系中，铜稳态失衡与血管内皮损伤的关联备受关注^［6-9］。生理状态下，铜离子通过结合金属伴侣蛋白维持动态平衡，但胞内铜过载可干扰脂质代谢并激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶系统，导致线粒体氧化磷酸化解偶联和活性氧过量生成^［10］。铜过载诱导的氧化应激可通过激活PERK-CHOP通路增强ERS反应，形成“氧化应激-ERS-内皮损伤”恶性循环^［11］。而铜螯合剂四硫代钼酸盐（tetrathiomolybdate, TTM）可通过抑制血管生成和炎症反应，显著改善血管损伤和心脏功能^［12］。

然而，铜稳态失衡是否通过ERS调控网络参与KD血管内皮损伤的分子机制尚未明确，本研究拟系统阐明铜过载介导的ERS信号转导在KD内皮损伤中的作用机制，为开发基于铜稳态调控的新型治疗策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）由南通大学附属医院妇产科实验室赠予，白色念珠菌（CCTCC AY 2018005）由中国典型培养物宝藏中心提供。主要试剂包括胎牛血清（北京沃卡威生物公司），TTM、红氨酸（Sigma，美国），青霉素链霉素双抗培养基，胰蛋白酶消化液，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒（上海珀赫生物科技有限公司），CCK8试剂（上海东仁化学科技有限公司），兔抗人CHOP、鼠抗兔β-actin、AMG PERK 44（上海美迪西生物医药有限公司），鼠抗人GRP78、兔抗人PERK（上海泽恩生物科技有限公司），兔抗人ATF6（上海艾博抗贸易有限公司），羊抗鼠、羊抗兔荧光二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），MCF 10A培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）试剂（河南赛诺特生物技术有限公司），ECMatrix胶（Sigma，美国）。

1.2　白色念珠菌细胞壁β-葡聚糖的提取物制备

参考文献［13］的方法制备白色念珠菌细胞壁β-葡聚糖的提取物（Candida albicans cell wall secreted proteins, CAWS），将白念珠菌接种于5 L沙氏培养基中，37℃条件下培养48 h。随后采用C-limiting培养基孵育2 d。加入等体积无水乙醇4℃过夜后收集沉淀，蒸馏水搅拌重悬，以5 000 r/min离心5 min收集上清并加入等体积无水乙醇4℃过夜。再次离心收集沉淀，丙酮干燥，无菌生理盐水溶解备用。

1.3　构建KD小鼠模型

采用Takahashi等^［14］的方法诱导念珠菌相关KD动物模型。将4周龄雄性C57BL/6小鼠80只［生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009，使用许可证号：SYXK（苏）2017-0046］随机均分为对照组、KD组、KD+TTM组和KD+内质网应激抑制剂AMG PERK 44（AMG）组。除对照组外，各组小鼠于实验第1~5天上午同一时间依次腹腔注射8 mg的CAWS，对照组小鼠腹腔注射相同体积生理盐水。CAWS注射后第6天，KD+TTM组给予TTM灌胃（5 mg/（kg·d），灌胃体积500 μL，持续7 d）。KD+AMG组予AMG灌胃（5 mg/kg，单次灌胃，灌胃体积500 μL）。于CAWS末次注射后的第2周每组随机抽取6只小鼠处死，取心脏组织及冠状动脉标本，行HE染色病理学检查，观察心脏及冠状动脉病变情况；同时，剥离腹主动脉，拍照并使用Image J软件测量腹主动脉直径和面积。本研究获南通大学医学院动物伦理委员会批准（批准号：S20220303-007）。

1.4　心脏组织HE和红氨酸铜染色

第14天每组随机选10只小鼠取心脏组织，4％多聚甲醛固定48 h，脱水，石蜡包埋切片，HE染色观察心脏冠状动脉炎性浸润。使用Image J软件分析炎性细胞数量。

将0.1%红氨酸乙醇液与10%醋酸钠按1∶20的比例混合均匀，将切片浸入混合液中，于37℃水浴锅中处理3 d；随后依次用70%乙醇浸洗2次，每次10 min；无水乙醇浸洗2次，每次3 h；蒸馏水浸洗3次。用核固红复染3 min，经无水乙醇3缸脱水、正丁醇透明5 min、二甲苯透明5 min，用中性树胶封片。采用显微镜镜检并采集图像进行分析。

1.5　免疫荧光

组织切片经抗原修复后，5% BSA封闭，一抗（CHOP按1∶5 000稀释、GRP78按1∶1 000稀释）4℃孵育过夜，Alexa Fluor 488二抗室温避光孵育2 h，DAPI染核后荧光显微镜观察。

1.6　透射电镜

取样心脏组织2 mm×2 mm大小，立即放入戊二醛电镜液中预固定。依次固定、包埋、烘烤后，用LKb超薄切片机切片，切片厚度为60~80 nm，切片用饱和醋酸双氧铀染色30 min，用枸橼酸铅染液染色5 min，通过电镜观察并拍照。

1.7　细胞培养与分组

HUVEC在含10%胎牛血清、1%双抗的完全培养基中，于37℃、5% CO₂条件下常规培养。选取2023年10月—2024年9月期间驻马店市中心医院儿科健康体检儿童及KD患儿血清，经56℃灭活30 min后，0.22 μm滤膜过滤备用。细胞分为对照组（健康血清处理24 h）、KD组（KD血清处理24 h）、KD+TTM组（KD血清联合20 μmol/L TTM处理24 h）。

1.8　CCK8检测

将对数生长期HUVEC配制成浓度为5×10⁴个细胞/mL的细胞悬液，接种于96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，每组分别于0、6、12、24、48、72 h加入10 μL CCK8试剂，孵育2 h。使用酶标仪在450 nm波长处检测吸光度，计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）。实验独立重复3次。

1.9　流式细胞术

消化收集各组细胞，调整细胞密度至1×10⁶个细胞/mL。用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞，离心（1 000 r/min，5 min）弃上清，重复洗涤2~3次。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡：取500 μL Binding Buffer重悬细胞，分装至流式管，依次加入5 μL Annexin V-FITC和PI，避光孵育15 min。使用流式细胞仪（BD FACSCalibur）进行检测。实验独立重复3次。

1.10　细胞划痕实验

取对数生长期细胞，调整细胞密度至5×10⁵个细胞/mL，接种于6孔板中。待HUVEC细胞融合度达80%时，用细胞刮刀垂直于培养板底部的参考线，划出一条直线划痕。无血清培养基培养24 h，在倒置显微镜下观察。划痕愈合率（%）=［（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度］×100%。实验独立重复3次。

1.11　细胞成管实验

各组细胞接种于预铺ECMatrix胶的96孔板中，37℃孵育6 h。倒置相差显微镜观察管状结构形成。使用Image J定量分析小管数目。实验独立重复3次。

1.12　Western blot检测

RIPA裂解液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）提取细胞及小鼠心脏组织蛋白，BCA法定量。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳转膜后，5%脱脂乳封闭，分别与CHOP（1∶5 000）、ATF6（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、PERK/p-PERK（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）一抗4℃孵育过夜，HRP二抗（1∶10 000）室温孵育1 h。ECL显影后Image J进行定量分析。实验独立重复3次。

1.13　统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料数据以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1　各组小鼠心脏组织中铜盐沉积情况比较

红氨酸铜染色结果显示，与对照组相比，KD组血管壁铜盐沉积明显增多；KD+TTM组和KD+AMG组血管壁铜盐沉积较KD组减少。见图1。

2.2　TTM及AMG对KD小鼠血管内皮的影响

HE染色结果显示，与对照组相比，KD组冠状动脉内皮细胞肿胀，内皮下中性粒细胞聚集，淋巴细胞浸润明显；与KD组相比，KD+AMG组和KD+TTM组冠状动脉内皮细胞肿胀减轻，炎性细胞浸润减轻（P<0.05）。透射电镜观察显示，与对照组相比，KD组腹主动脉病变明显扩张，腹主动脉直径和面积增大（P<0.05）；与KD组相比，KD+TTM组和KD+AMG组腹主动脉病变减轻，腹主动脉直径和面积缩小但未恢复正常（P<0.05）。见图1、表1。

2.3　TTM及AMG对KD小鼠ERS的影响

透射电镜显示，与对照组相比，KD组内质网结构紊乱并明显扩张肿胀；与KD组相比，KD+TTM组和KD+AMG组内质网肿胀减轻，结构清晰。免疫荧光显示，与对照组（分别为4.62±0.04、6.35±0.04）相比，KD组（分别为21.13±0.10、15.21±0.21）内质网标记蛋白GRP78、CHOP荧光强度增强（P<0.05）；与KD组相比，KD+TTM组（分别为6.10±0.08、10.65±0.11）和KD+AMG组（分别为8.96±0.06、10.72±0.09）GRP78、CHOP荧光强度减弱（P<0.05）。见图2。

2.4　TTM对KD血清诱导的HUVEC细胞活力的影响

CCK8结果显示，KD组不同时间点细胞活力较对照组降低，KD+TTM组细胞活力较KD组升高（P<0.05）。见表2。

2.5　TTM对KD血清诱导的HUVEC血管生成、迁移和凋亡的影响

与对照组相比，KD组小管数、划痕愈合率显著下降，细胞凋亡率升高（P<0.05）；与KD组相比，KD+TTM组小管数、划痕愈合率升高，细胞凋亡率下降（P<0.05）。见图3、表3。

2.6　TTM对KD血清诱导的HUVEC中ERS的影响

与对照组相比，KD组GRP78、CHOP、ATF6和p-PERK蛋白表达水平升高（P<0.05）；与KD组相比，KD+TTM组GRP78、CHOP、ATF6和p-PERK蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表4、图4。

3 讨论

铜离子作为必需微量元素，其生理功能的发挥高度依赖于机体的稳态调控。铜离子缺乏会引起心肌肥厚、心肌能量不足、氧化应激以及基因异常表达^［15］，进而导致多种心血管疾病。补充铜能够促进内皮细胞生长因子及血管再生，改善心肌肥厚并可能减少心肌细胞纤维化^［16］。而过量铜则可能诱发氧化应激、细胞凋亡和炎症等反应^［17-19］，导致心血管功能障碍。本研究通过动物实验和细胞实验，为铜离子参与KD冠状动脉病变的发病机制提供了直接实验证据。

为揭示铜稳态失衡与ERS之间的交互作用机制。本研究发现，KD组小鼠心脏组织和HUVEC中ERS标志蛋白表达较对照组显著上调；透射电镜观察发现，KD组内皮细胞内质网呈现特征性囊泡扩张和核糖体脱落现象。铜螯合剂TTM干预可有效降低小鼠心脏组织铜沉积，下调小鼠心脏组织和HUVEC中ERS标志蛋白表达，提示铜过载可能是KD发病过程中ERS的关键触发因素。有研究证实，铜过载可诱导肝细胞ERS，通过CHOP-Caspase-12途径激活细胞凋亡信号^［20］，慢性铜暴露不仅可诱导ERS，还能通过激活NLRP3炎症小体加剧炎症级联反应^［21-22］。这些证据共同构建了“铜过载-ERS-内皮凋亡-血管内皮损伤”的病理轴，为理解KD血管病变提供了新的分子机制框架。

本研究动物实验结果发现，经TTM处理后的KD小鼠，铜沉积程度显著改善，冠状动脉损伤和腹主动脉扩张明显改善；细胞实验结果发现，KD+TTM组HUVEC较KD组细胞增殖、迁移及成管能力明显改善。结果表明，铜过载对血管内皮功能具有调控作用。有研究表明，TTM除发挥铜稳态调节作用外，可能通过下调成纤维细胞生长因子2和血小板衍生生长因子亚基B等促血管生成因子，发挥抗增殖效应^［23］。这些关于TTM的治疗效果评估，为开发靶向铜代谢的KD治疗策略提供了重要的前期实验依据。

本研究仍存在一定局限性，后续将结合单细胞转录组测序技术，深入解析铜代谢相关基因在KD不同病程阶段的动态变化规律。

综上，本研究证实高浓度铜离子在KD血管内皮损伤中起关键作用，铜过载可通过介导ERS触发血管内皮损伤，而TTM能显著改善ERS标志蛋白异常表达，并修复血管内皮功能。这些发现为KD的精准治疗提供了新的理论和实验依据。

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