高氧对新生大鼠海马区N-甲基-D-天冬氨酸受体1及其突触相关分子表达的影响

Effects of hyperoxia on the expression of hippocampal N-methyl D-aspartate receptor 1 and its synapse-associated molecules in neonatal rats

摘要

目的 探究高氧对新生大鼠海马区N-甲基-D-天冬氨酸受体1（N-methyl-D-aspartate receptor 1, NMDAR1）及其突触相关分子大麻素受体1（cannabinoid receptor 1, CB1R）、突触后致密物（postsynaptic density, PSD）95及突触素（synapsin, SYN）表达的影响。 方法 选取1日龄Sprague-Dawley新生大鼠，分为高氧组和对照组（n=8），高氧组持续吸入80%±5%氧气，对照组吸入空气，干预7 d。分别于高氧暴露后1、3、7 d，采用苏木精-伊红染色观察脑组织病理学改变，免疫组织化学染色、蛋白质印迹法及实时荧光定量PCR检测海马区NMDAR1、CB1R、PSD95和SYN蛋白及mRNA表达变化。 结果 高氧暴露7 d时，高氧组脑组织神经细胞密度降低，排列紊乱。与对照组相比，高氧暴露1 d时，高氧组CB1R mRNA及NMDAR1、CB1R蛋白表达显著下调，SYN蛋白表达显著上调（P<0.05）；高氧暴露3 d时，高氧组NMDAR1、CB1R及SYN mRNA表达显著下调（P<0.05），NMDAR1、CB1R蛋白表达显著下调（P<0.05），PSD95、SYN蛋白表达显著上调（P<0.05）；高氧暴露7 d时，高氧组NMDAR1、CB1R蛋白表达显著上调（P<0.05）。 结论 持续高氧暴露可导致新生大鼠海马区NMDAR1及其突触相关分子的表达水平发生时间依赖性改变。

Abstract

Objective To investigate the effects of hyperoxia on the expression of N-methyl-D-aspartate receptor 1 (NMDAR1) and its synapse-associated molecules, including cannabinoid receptor 1 (CB1R), postsynaptic density 95 (PSD95), and synapsin (SYN), in the hippocampus of neonatal rats. Methods One-day-old Sprague-Dawley neonatal rats were randomly divided into a hyperoxia group and a control group (n=8 per group). The hyperoxia group was exposed to 80% ± 5% oxygen continuously, while the control group was exposed to room air, for 7 days. At 1, 3, and 7 days after hyperoxia exposure, hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe histopathological changes in the brain. The expression levels of NMDAR1, CB1R, PSD95, and SYN proteins and mRNAs in the hippocampus were detected by immunohistochemistry, Western blotting, and quantitative real-time PCR. Results After 7 days of hyperoxia exposure, the hyperoxia group showed decreased neuronal density and disordered arrangement in brain tissue. Compared with the control group, after 1 day of hyperoxia exposure, CB1R mRNA and both NMDAR1 and CB1R protein expression in the hyperoxia group were significantly downregulated, while SYN protein expression was significantly upregulated (P<0.05). After 3 days, mRNA expression of NMDAR1, CB1R, and SYN was significantly decreased (P<0.05); NMDAR1 and CB1R protein expression was significantly downregulated (P<0.05), while PSD95 and SYN protein expression was significantly upregulated (P<0.05). After 7 days of hyperoxia, the protein expression of NMDAR1 and CB1R was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions Continuous hyperoxia exposure induces time-dependent changes in the expression levels of NMDAR1 and its synapse-associated molecules in the hippocampus of neonatal rats.

Graphical abstract

关键词

脑发育 / 高氧 / 海马 / NMDA受体1 / 新生大鼠

Key words

Brain development / Hyperoxia / Hippocampus / NMDA receptor 1 / Neonatal rat

氧是人类生存所必需的，但越来越多的证据表明氧毒性的存在，高氧可导致机体损害^［1］。新生儿作为发育中的个体，对高氧更为敏感，现已明确，不恰当地给予氧疗导致的高氧血症与新生儿不良预后密切相关^［2-4］。既往研究多聚焦于早产儿视网膜病、慢性肺疾病与高氧的相关性^［5-6］。近年研究则证实，高氧对发育中的脑可造成不可逆的损伤，其损伤程度和易感部位与吸入氧浓度、高氧暴露的时间及脑成熟程度等因素相关，是导致新生儿神经系统不良预后的重要因素之一^［7-9］。高氧不仅可造成神经细胞死亡，还会干扰脑发育过程，破坏发育中脑的神经可塑性及髓鞘发育^［10-12］。本研究组既往研究发现，高氧暴露导致新生大鼠海马区mRNA表达谱发生显著变化，这与包括突触形成在内的多条信号通路相关^［13］。

突触是神经元之间实现功能联系的关键部位，也是信息传递的核心结构。在脑发育过程中，正常突触的建立是神经系统构筑的基础，而突触发育异常将造成脑发育和功能的异常。根据突触传导的性质，分为兴奋性突触和抑制性突触，在脑发育早期，以兴奋性突触占优势。海马作为参与学习、记忆及定向转换的重要脑区，有密集的突触^［14］。在发育中的海马区，N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）作为兴奋性神经递质谷氨酸的主要受体之一，除参与兴奋性突触传导之外，还与神经元网络活动和认知、神经系统的发育、学习和记忆密切相关^［15-17］，NMDAR1是构成NMDAR的基础亚单位，而大麻素受体1（cannabinoid receptor 1, CB1R）、突触后致密物（postsynaptic density, PSD）95及突触素（synapsin, SYN）等突触相关分子则与NMDAR1功能调节密切相关，深度参与脑发育过程^［18］。高氧是否直接影响这些分子的表达，从而参与高氧性脑损伤，其机制尚不清楚。本研究通过建立新生大鼠高氧暴露模型，研究上述分子在新生大鼠海马区的表达变化，旨在进一步阐明高氧所致发育中脑损伤的机制。

1 材料与方法

1.1　新生大鼠高氧暴露模型的建立及实验分组

取1日龄新生Sprague-Dawley大鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），制作新生大鼠高氧暴露模型^［19-22］，依据是否吸入高氧，将大鼠分为高氧组和对照组，每组各8只。高氧组持续吸入高浓度氧气（医用制氧机：欧格斯，型号OZ-5-01TWO），氧浓度维持在80%±5%（v/v）（氧浓度测定仪：艾普，型号CY-12C），对照组为同日龄吸入空气的新生大鼠。每组取4只新生大鼠分离海马组织，分别提取蛋白和RNA，用于蛋白印迹和实时定量PCR实验；每组另取4只新生大鼠的脑组织用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）和免疫组织化学染色。

1.2　HE染色

于高氧吸入后1、3、7 d断头取脑，每组大脑半球经4%多聚甲醛固定24 h，冲洗后脱水、透明、石蜡包埋。切片机切取4 μm厚切片，干燥后先后置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脱蜡，再经梯度乙醇水化。采用HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）对切片进行染色。

1.3　实时荧光定量PCR

采用RNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取总RNA，Nanodrop 2000超微量分光光度计（Thermo，美国）测定总RNA的浓度和纯度，所有样本的光密度（optical density, OD）₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8~2.0。按照EvoM-MLV反转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书进行反转录。

定量PCR操作按照SYBR Green Premix Pro TaqHS试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书进行，反应体系（20 μL）：10 μL SYBR Green Premix Pro TaqHS Premix（Rox Plus）、上、下游引物各0.4 μL、0.5 μL ROX参比染料、2 μL cDNA模板、6.7 μL灭菌用水，引物序列见表1。应用实时荧光定量PCR仪（ABI QuantStudio 6 Flex, ThermoFisher, 美国）进行定量PCR，循环参数为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，55℃、72℃退火延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，计算双孔Ct值均值，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。实验独立重复3次。

1.4　蛋白质印迹法

海马标本剪碎后置于RIPA裂解液（1% Triton X-100、1% sodium deoxycholate、0.1% SDS），冰上裂解20 min；粉碎打匀后再次冰上裂解30 min，4℃、13 000 r/min离心10 min，取上清。采用紫外吸收法测定蛋白浓度，按比例加入5×加样缓冲液后，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，每条泳道上样30 μg（15 μL），两侧泳道加蛋白marker。用半干法转蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶封闭1 h后，加入一抗［兔抗大鼠NMDAR1（长沙艾碧维生物科技有限公司）、CB1R（Protein Tech，美国为）、PSD95（Protein Tech，美国）（均1∶500），兔抗SYN（Protein Tech，美国；1∶200），兔抗大鼠β-actin（Protein Tech，美国；1∶3 000）］，4℃孵育过夜；用TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记二抗［山羊抗兔多克隆抗体（Protein Tech，美国）；1∶1 000］，室温孵育2 h。TBST洗膜后加ECL发光液，数字凝胶成像系统扫描，运用Image J软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白β-actin灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。实验独立重复3次。

1.5　免疫组化染色

取双侧大脑半球制作石蜡切片，经3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶、正常山羊血清封闭1 h后，滴加一抗［兔抗大鼠NMDAR1、CB1R（均1∶500），PSD95（1∶200）、SYN（1∶100）］，4℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记二抗（山羊抗兔，1∶1 000），室温孵育30 min。DAB显色法显色后树胶封片。于光学显微镜下选取海马区细胞分布均匀的视野（每只大鼠选取2个）进行观察。采用Image J软件测定平均光密度（average optical density, AOD）值，代表目的蛋白表达水平。

1.6　统计学分析

采用GraphPad Prism 10.2.3、SPSS 27.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（\overline{x}\pm s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1　高氧对新生大鼠海马区病理改变的影响

对照组和高氧组大鼠在实验过程中无死亡，无惊厥发作，无运动异常。HE染色结果显示，高氧暴露7 d时，高氧组海马区神经元密度降低，排列紊乱。见图1。

2.2　高氧暴露对新生大鼠海马区NMDAR1表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，高氧暴露3 d时，高氧组NMDAR1 mRNA表达水平明显低于对照组（P<0.05）；高氧暴露1 d、7 d时，对照组与高氧组NMDAR1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。蛋白质印迹法结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组NMDAR1蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，高氧组NMDAR1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）。免疫组化结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组NMDAR1 AOD值低于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，高氧组NMDAR1 AOD值高于对照组（P<0.05）。见表2、图2。

2.3　高氧暴露对新生大鼠海马区CB1R表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组CB1R mRNA表达水平低于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，两组CB1R mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。蛋白质印迹法结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组CB1R蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，高氧组CB1R蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）。免疫组化结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组CB1R AOD值低于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，高氧组CB1R AOD值高于对照组（P<0.05）。见表3、图3。

2.4　高氧暴露对新生大鼠海马区SYN表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，高氧暴露3 d时，高氧组SYN mRNA表达水平低于对照组（P<0.05），高氧暴露1 d、7 d时，两组SYN mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。蛋白质印迹法结果显示，高氧暴露1 d、3 d时，高氧组SYN蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）；高氧暴露7 d时，两组SYN蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。免疫组化结果显示，3个时间点高氧组SYN AOD值高于对照组（P<0.05）。见表4、图4。

2.5　高氧暴露对新生大鼠海马区PSD95表达的影响

实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，3个时间点高氧组PSD95 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。蛋白质印迹法结果显示，高氧暴露3 d时，高氧组PSD95蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）；高氧暴露1 d、7 d时，两组PSD95蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。免疫组化结果显示，高氧暴露3 d、7 d时，高氧组PSD95 AOD值高于对照组（P<0.05），高氧暴露1 d时，两组PSD95 AOD值比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表5、图5。

3 讨论

高氧对发育中脑的损害，在早产儿中与脑室周围白质软化、颅内出血发生率增高密切相关^［7-9］；而足月儿应用高氧复苏时，长期不良神经系统预后的发生率明显高于应用空气复苏者^［23］。将体外培养的少突胶质细胞前体细胞暴露于高氧下，其增殖、分化受阻，死亡增加，会导致脑白质发育障碍^［24-25］。本研究中，HE染色结果显示，持续高氧暴露7 d时海马区神经元密度明显降低，进一步证实了高氧对发育中脑损伤的影响。

高氧引起发育中脑损伤的机制复杂，目前研究认为氧自由基损伤、发育中脑抗氧化能力不足、炎症过程、细胞活动及基因表达调控的异常等均可能参与其中^［26-28］。研究发现，NMDAR1及其突触相关分子在对高氧敏感的海马区表达，与兴奋性突触功能、脑发育及脑功能密切相关^［29-31］。在发育中的海马区，突触前膜释放谷氨酸，可激活突触后膜的NMDAR1，诱导突触后电位产生。同时，NMDAR1激活会使突触后膜内环氧化酶-2表达上调，后者催化花生四烯醇甘油产生内源性大麻素；内源性大麻素通过突触前膜的CB1R，下调细胞内钙离子浓度，从而抑制谷氨酸释放，负反馈调节NMDAR1活性^［32-33］。研究表明，当NMDAR1表达低下或功能受抑时，会损害认知功能，引发癫痫发作、神经系统炎症等^［34-37］，而NMDAR1过度激活时，会引发精神疾病、亨廷顿舞蹈病等，导致肌肉协调能力和认知能力下降，造成不可逆的脑损伤^［38-39］。生理状态下，CB1R的表达可增强情绪与学习的可塑性^［40］，而CB1R过度激活则可能影响N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）能突触的持续重塑，扰乱大脑的发育与成熟^［41］。本研究显示，高氧暴露1 d和3 d时，新生大鼠海马区NMDAR1蛋白表达下调，这会抑制NMDAR1的功能；但不排除在高氧暴露下，谷氨酸释放增加可过度激活突触后膜的NMDAR1并产生兴奋毒性损害，机体通过下调NMDAR1的表达以减轻损害。高氧暴露1 d和3 d时，CB1R蛋白和mRNA表达下调，可能是机体对NMDA能突触功能的自我调节。高氧暴露7 d时，NMDAR1和CB1R蛋白表达同步上调，可能为代偿性调整。

SYN是存在于轴突末梢的纤维状磷酸蛋白，与突触小泡之间及突触小泡与细胞骨架之间的交联相关，可促进突触前膜谷氨酸突触囊泡的运动和释放，进而调控突触功能^［42］。本研究显示，高氧暴露1 d和3 d时，SYN蛋白表达上调，这会促进突触前膜释放谷氨酸，其意义与CB1R蛋白表达下调相似，即通过促进谷氨酸释放，拮抗因NMDAR1下调导致的NMDA能突触功能降低。

PSD95蛋白主要定位于神经元突触后膜的PSD区，通过与突触后膜的NMDAR1结合，调节抑制性和兴奋性突触数量的平衡，增加突触稳定性，是突触成熟的关键调节因子^［43］。本研究发现，高氧暴露3 d时，PSD95蛋白表达上调，但由于NMDAR1表达下调，其未必能增强突触功能；此外，PSD95蛋白还可与其他蛋白质相互作用，形成信号复合物，从而调控突触功能。

研究发现，上述分子除参与调节突触功能外，还可通过调控突触可塑性参与海马区的正常发育，且这一过程具有时空特异性^［44-45］。本研究发现，长期高氧暴露可改变上述蛋白的表达水平，其是否会对脑发育产生长期影响，仍需进一步深入研究。

本研究中，高氧暴露下新生大鼠海马区NMDAR1、CB1R、PSD95及SYN的mRNA与蛋白表达在相同时间点变化不完全一致，这可能因高氧对这些分子的影响不仅作用于转录水平，还涉及mRNA翻译及修饰过程，体现其对脑内蛋白表达调节的复杂性；亦可能因所选时间点局限导致结果偏倚。

综上所述，持续高氧暴露可影响新生大鼠海马区NMDAR1及其突触相关分子CB1R、PSD95及SYN的表达，且呈时间依赖性，这一变化可能参与高氧所致的发育期脑损伤，提示应避免发育中脑组织长期处于高氧环境。

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